基于pH敏感分裂内切酶的新型一步法细胞外囊泡蛋白装载与递送系统

《Scientific Reports》：Split-intein-mediated engineering of VSV-G-free extracellular vesicles for enhanced cargo loading and delivery of functional proteins

摘要

细胞外囊泡（EVs）是一类异质性膜性纳米颗粒。由于其独特性质，被认为是有前景的治疗用纳米载体。货物装载和向靶细胞的功能性递送是EV研究中受到越来越多关注的挑战性领域。在此，我们介绍了一种基于pH敏感分裂内切酶的新型一步法、不含VSV-G蛋白的装载系统，以提高蛋白在EVs中的装载效率。为此，我们将EV膜蛋白CD9与NpuN组分融合，并将目标货物与NpuC组分融合。我们推测NpuN与NpuC之间的相互作用促进了融合货物向EVs的装载。我们预期NpuC与货物之间的pH敏感序列会在产生细胞的腔内囊泡或受体细胞的内体中酸性pH条件下发生切割。我们的结果显示，与被动装载相比，NpuN/NpuC系统将DsRed2和tdTomato在EVs中的装载效率提高了1.3倍。我们利用该系统评估了蛋白向受体细胞的功能性递送。为此，我们将piggyBac转座酶与NpuC融合，并将EVs加入报告细胞中，其中piggyBac的外切酶活性与5′ITR-EGFP-多聚腺苷酸化信号-3′ITR的切除以及mCherry的表达一致。分离的EVs通过透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）以及点印迹法检测了工程化mEmerald-CD9膜蛋白和囊泡组分中的DsRed2货物。未检测内源性EV标志物或阴性污染标志物；因此，未通过蛋白标志物分析确定EV身份和样品纯度。