《Journal of Agriculture and Food Research》：Unraveling the cultivar-associated aroma profiles of
Camellia sinensis via untargeted and targeted volatile metabolomics coupled with molecular docking
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茶树（Camellia sinensis）是全球重要的经济作物，其鲜叶中挥发性代谢物（volatile metabolites, VMs）的种类、浓度及相对比例共同决定茶叶的香气品质。本研究以国家种质杭州茶树圃中20个不同地理来源的茶树品种为材料，在一致的栽培
茶树（Camellia sinensis）是全球重要的经济作物，其鲜叶中挥发性代谢物（volatile metabolites, VMs）的种类、浓度及相对比例共同决定茶叶的香气品质。本研究以国家种质杭州茶树圃中20个不同地理来源的茶树品种为材料，在一致的栽培和采样条件下采集一芽一叶鲜叶样品，采用顶空固相微萃取-气相色谱-串联质谱（HS-SPME–GC–MS/MS）技术对鲜叶挥发性代谢物进行系统比较分析。共检测到65种VMs，分属9个化学类别；按化合物数量计，醇类和酯类最为丰富（各占24.60%），而按相对丰度计，萜烯类占据主导地位（61.40%）。通过正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）结合变量投影重要性（VIP>1）筛选出16个判别性VMs，其中12个具有标准品和气味阈值信息的差异VMs采用外标法进行绝对定量，并计算气味活性值（odor activity values, OAVs）。结果表明，12个差异VMs在20个品种中的OAV均大于1，其中芳樟醇（linalool）、香叶醇（geraniol）、乙酸[(Z)-己-3-烯酯]（[(Z)-hex-3-enyl] acetate）、β-月桂烯（β-myrcene）和1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）的最大OAV超过1,000，提示其具有潜在的气味贡献。芳樟醇在全部品种中均高度富集，而香叶醇、橙花醇（nerol）、水杨酸甲酯（methyl salicylate）、吲哚（indole）和β-月桂烯等呈现品种特异的积累模式。基于文献将12个差异VMs归入萜类、苯丙烷类/氨基酸来源及脂肪酸来源三条主要生物合成途径，为理解品种间积累差异提供了生化背景。此外，研究人员对选定的VM-蛋白对进行了探索性分子对接（AutoDock Vina），预测了配体构象和残基接触，其中橙花醇-萜烯合酶（TPS）复合物获得最低的Vina评分（?6.1 kcal/mol），为后续生化验证提供了结构假设。本研究提供了茶树品种间挥发性代谢物多样性的比较数据集，为品种特异性茶产品的香气定向开发及后续感官、加工和机理性验证奠定了基础。
论文解读
一、研究背景与意义
茶叶（Camellia sinensis）作为全球重要的经济作物，其鲜叶富含茶多酚、氨基酸、茶多糖及维生素等多种功能成分，已被证实具有抗癌、抗氧化、抗炎和降压等多种健康益处。香气是评价茶叶品质的关键指标，也是消费者选择茶叶的首要决定因素之一。香气特征由茶叶中挥发性代谢物（VMs）的种类、浓度及相对比例共同决定，而茶树品种和加工工艺被认为是影响茶叶香气品质的两大主导因素。鲜叶作为茶叶加工的起始原料，其品质深受品种特性的影响，为后续香气形成提供生化基础。然而，与加工茶相比，鲜叶中挥发性成分变异的系统研究仍相对有限。以往研究多聚焦于成品茶的香气特征或加工过程中（萎凋、杀青、干燥等）VMs的动态变化，对不同茶树种质鲜叶原始挥发性组成进行比较的信息尚不完整，尤其是结合差异VMs筛选和生物合成背景的系统性研究更为缺乏。因此，系统比较不同中国茶树品种鲜叶的挥发性特征谱，对于理解鲜叶香气相关化学多样性、指导品种特异性茶产品开发具有重要的科学意义和实践价值。
二、研究内容概述
本研究以国家种质杭州茶树圃中统一栽培和田间管理条件下生长的20个不同地理来源的茶树品种为材料，于2024年3月20–21日按照统一采摘标准采集一芽一叶鲜叶样品，每个品种设置3个独立生物学重复。研究人员采用HS-SPME–GC–MS/MS技术对鲜叶挥发性代谢物进行系统表征，结合多变量与单变量统计分析鉴定判别性VMs，利用外标法对选定的差异VMs进行绝对定量，并通过OAVs评估其潜在气味贡献。最后，基于已建立的植物挥发性生物合成途径对选定VMs进行生化背景解读，并采用分子对接技术评估其与生物合成相关蛋白的预测结构兼容性。
三、主要关键技术方法
本研究采用了以下几项关键技术方法：一是顶空固相微萃取-气相色谱-串联质谱（HS-SPME–GC–MS/MS）技术，用于鲜叶挥发性代谢物的全谱检测与相对定量，以癸酸乙酯为内标；二是多变量统计分析，包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），结合200次置换检验评估模型稳健性，以VIP>1筛选判别性VMs；三是外标法定量结合气味活性值（OAV）计算，采用化合物特异性标准曲线进行绝对定量，并根据文献报道的嗅觉阈值计算OAV以优先筛选潜在气味相关化合物；四是分子对接分析，利用AutoDock Vina对选定的VM-蛋白对进行探索性对接模拟，预测配体构象和残基接触。
四、研究结果
4.1 鲜茶叶片中挥发性特征谱总览
HS-SPME–GC–MS/MS分析在20个茶树品种鲜叶中共检测到65种VMs，分属9个化学类别。按化合物数量计，醇类和酯类最为丰富，各占24.60%（16种），其次为萜烯类（18.50%，12种）和醛类（9.20%，6种）。按20个品种的平均相对丰度计，萜烯类占据最大比例（61.40%），其次为酯类（24.40%）和醇类（9.80%）。品种层面，JMD、BYTZ和EC7H的萜烯类比例较高（>60%，部分>70%），GH3H的酯类比例相对较高（44.13%），QM6001的醛类比例较高（约2.43%），FDDB的醇类比例较高（>16%）。这些结果表明不同茶树品种在VMs的相对丰度和化学类别组成上存在显著的品种关联差异。
4.2 挥发性代谢物的OPLS-DA分析
OPLS-DA得分图显示20个品种沿第一预测主成分（46.10%）和正交主成分（20.90%）呈明显离散分布，所有样本均位于95% Hotelling T2椭圆内，无异常值。模型解释和预测性能良好，R2X、R2Y和Q2值分别为0.865、0.910和0.820，200次置换检验的R2和Q2截距分别为0.344和?0.808，表明模型未过拟合。层次聚类分析（HCA）在欧氏距离阈值15,000处将20个品种分为四个簇，与OPLS-DA得分空间的总体分化基本一致。以VIP>1为筛选标准，共鉴定出16个判别性VMs，主要为萜类、醇类和酯类化合物，其中12个具有标准品和气味阈值信息的VMs进入后续靶向定量和OAV评估。
4.3 气味活性值分析
12个差异VMs在20个品种中的OAV均大于1，表明它们在所采用的阈值条件下均为候选气味相关VMs。6个VMs的最大OAV超过1,000，包括芳樟醇（285,164.09–1,088,490.12）、香叶醇（2,468.19–151,044.72）、乙酸[(Z)-己-3-烯酯]（25,733.21–86,271.19）、β-月桂烯（6,077.16–49,542.15）、1-辛烯-3-醇（1,092.84–8,064.91）和水杨酸甲酯（596.52–3,174.44）。芳樟醇在所有选定VMs中OAV量级最高（10?–10?），在QM809中达到最高值（1.09×10?），这不仅与其定量浓度有关，也与其极低的嗅觉阈值（0.22 μg/L）密切相关。不同品种呈现化合物特异的OAV组合：JMD的香叶醇（151,044.72）和β-月桂烯（49,542.15）OAV最高，SFX的乙酸[(Z)-己-3-烯酯] OAV最高（86,271.19）。这些差异提示不同品种拥有各自独特的潜在气味相关VMs组合。
4.4 差异挥发性代谢物的香气风味轮与含量分布
根据文献报道的气味描述符，12个差异VMs被分为四类：香叶醇、苯乙醇、芳樟醇、吲哚、橙花醇和反式-橙花叔醇主要与花香相关；1-辛烯-3-醇和水杨酸甲酯以草本香为特征；(E)-己-3-烯-1-醇和乙酸[(Z)-己-3-烯酯]与青草/清新气味相关；β-月桂烯和苯甲醇归入果香类别。定量结果显示，芳樟醇在全部20个品种中均高度丰富（>250.00 μg/g），QM809（957.87 ± 18.98 μg/g）和EC7H（957.14 ± 4.60 μg/g）中含量最高。香叶醇在JMD中显著富集（604.18 μg/g），橙花醇在ZC108、QM6001和BYTZ中含量较高，苯乙醇在FDDB中含量最高，吲哚在GH3H中尤为突出（>30.00 μg/g），反式-橙花叔醇在LJCY中达到最高水平（>30.00 μg/g）。水杨酸甲酯在GH3H和QM6001中含量较高，1-辛烯-3-醇在JGY中含量最高，(E)-己-3-烯-1-醇在BYYH中最高，乙酸[(Z)-己-3-烯酯]在SFX中最丰富，β-月桂烯在JMD中积累最强（237.80 μg/g），苯甲醇在QM6001中含量最高。这些结果表明12个选定VMs在品种间呈现化合物特异的定量分布模式。
4.5 选定差异挥发性代谢物的生物合成背景
基于已建立的植物挥发性生物合成途径，12个差异VMs被归入三类：5个萜类相关VMs（芳樟醇、香叶醇、橙花醇、β-月桂烯和反式-橙花叔醇）、4个苯丙烷类/氨基酸来源VMs（苯乙醇、苯甲醇、水杨酸甲酯和吲哚）和3个脂肪酸来源VMs（(E)-己-3-烯-1-醇、乙酸[(Z)-己-3-烯酯]和1-辛烯-3-醇）。单萜类VMs的前体主要由质体中的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径供给，反式-橙花叔醇作为倍半萜主要与胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径相关，萜烯合酶（TPSs）催化异戊二烯前体形成结构多样的萜类产物。苯乙醇、苯甲醇和水杨酸甲酯被归入苯丙氨酸相关的芳香族挥发性形成网络，吲哚则与色氨酸相关生物合成网络关联。不饱和脂肪酸经LOX/HPL相关氧化生成绿叶挥发物中间体，再经还原、异构化和酰化反应转化为相应的醇和酯。这些生物合成框架为理解品种间积累差异提供了生化背景。
4.6 选定挥发性代谢物与生物合成相关蛋白的分子对接
分子对接分析在相同AutoDock Vina协议下预测的对接评分范围为?3.9至?6.1 kcal/mol。萜类相关配对中，橙花醇-TPS获得最低Vina评分（?6.1 kcal/mol），其次为反式-橙花叔醇-TPS/NES（?5.6 kcal/mol）和香叶醇-TPS（?5.1 kcal/mol）。水杨酸甲酯-SAMT和苯甲醇-β-葡萄糖苷酶分别获得?5.7和?5.2 kcal/mol的评分，乙酸[(Z)-己-3-烯酯]-AAT评分为?5.3 kcal/mol。预测的配体构象中观察到频繁的疏水接触和氢键接触。这些对接结果作为探索性计算预测，为后续生化验证提供了结构假设。
五、讨论与结论
本研究表明，20个茶树品种的鲜叶在挥发性组成上存在品种关联差异。65种VMs被检测到，12个选定的差异VMs经绝对定量和OAV评估后，芳樟醇在品种间广泛丰富，而香叶醇、橙花醇、水杨酸甲酯、吲哚和β-月桂烯呈现品种特异的积累模式。基于所采用的嗅觉阈值的OAV评估识别出具有潜在气味相关性的化合物，为后续感官和加工研究提供了优先候选。将这些差异VMs置于已建立的萜类、芳香族氨基酸/苯丙烷类和脂肪酸来源的生物合成框架中，为理解其积累模式提供了生化背景，并指明了进一步机理研究的方向。探索性分子对接提供了选定蛋白模型内预测的配体构象和配体-残基接触，作为后续生化验证的结构假设。本研究为比较茶树品种间挥发性多样性及其在加工过程中的转化和与香气形成的关系提供了基础。
