菲律宾本土植物源乳酸菌的比较外代谢组学（exometabolomics）：基于UHPLC–Q-TOF-MS的胞外代谢谱与菌株判别候选代谢物

《Journal of Agriculture and Food Research》：Comparative exometabolomic insights into indigenous Philippine plant-derived lactic acid bacteria

　　

首次对菲律宾本土植物源乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）进行比较外代谢组学（exometabolomics）表征。
来自尼帕树液（nipa sap）、本土薯蓣（indigenous yam）和特有竹（endemic bamboo）的植物相关LAB表现出不同的胞外代谢组谱。
推定注释的perlolyrine与pyroglutamyl-isoleucine扩展了已报道的LAB胞外代谢物多样性。
这些发现为未来针对本土植物相关LAB的后生元（postbiotic）研究提供了候选物。

Karen Jean Tejero Diez等研究人员围绕菲律宾本土植物来源乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）的胞外代谢多样性开展了比较外代谢组学（exometabolomics）研究。LAB日益被视为食品、健康和后生元（postbiotic）开发中有价值的生物活性代谢物来源。近年来，菌株水平代谢多样性证据不断增加，限制了对跨类群代谢性状的概括。植物相关环境，尤其热带和特有植物，是未充分探索的微生物库，可能蕴含具有独特代谢谱的LAB。已有研究从发酵根类作物、竹笋和植物汁液等植物来源基质中分离LAB，但许多独特分离株仍缺乏超越基因组和功能评估的深入表征。外代谢组学可表征微生物释放、消耗或生物转化的胞外代谢物，有助于识别菌株相关胞外表型和候选功能代谢物。然而，许多微生物代谢物因低丰度和可靠参考标准有限而难以表征；微生物培养基质复杂，培养基来源代谢物可能掩盖或干扰微生物来源化合物检测，因此需要与未接种对照进行对比。非靶向外代谢组学结合多变量和单变量统计可表征菌株相关代谢变异并发现判别特征。尽管如此，本土植物相关LAB的非靶向外代谢组学研究仍有限，已有研究多聚焦工业相关菌株或常见食用植物来源LAB，生态位不同的植物来源菌株在代谢组数据中代表性不足。基于此，研究人员采用超高效液相色谱–四极杆飞行时间质谱（ultra-high-performance liquid chromatography–quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UHPLC–Q-TOF-MS）非靶向外代谢组学，表征三个此前从不同植物相关生态位分离的菲律宾本土LAB菌株的细胞游离上清液（cell-free supernatants，CFSs）胞外代谢组：来自耐盐Nypa fruticans（nipa sap）的Lactobacillus paracasei 7060（方法中称Lacticaseibacillus paracasei 7060），来自本土块茎Dioscorea luzonensis Schauer（kamangeg）的Limosilactobacillus fermentum PJG11，以及来自特有竹Dendrocalamus merrillianus Elmer（bayog）的Lentilactobacillus hilgardii DSB22。研究目标是表征这些本土LAB的胞外代谢变异，识别与菌株判别相关的代谢物，并通过通路富集和功能基因组分析提供代谢背景。总体结论是，三个本土LAB菌株具有不同的胞外代谢组谱，若干推定注释为氨基酸衍生物、二酮哌嗪、有机酸和β-咔啉的特征在菌株中富集；其中L. paracasei 7060代谢谱最独特，β-咔啉相关特征富集；L. hilgardii DSB22表现为MRS相关特征广泛耗竭和吲哚-3-乳酸富集；L. fermentum PJG11表现为肽相关特征富集。该研究扩展了菲律宾本土LAB的外代谢组信息，并突出perlolyrine和pyroglutamylisoleucine等候选代谢物，为后续靶向筛选和后生元相关研究提供基础。

关键技术方法概览（不超过250字）：样本来源为菲律宾本土植物相关LAB：Lacticaseibacillus paracasei 7060来自Nypa fruticans（nipa sap），Limosilactobacillus fermentum PJG11来自Dioscorea luzonensis Schauer（kamangeg），Lentilactobacillus hilgardii DSB22来自Dendrocalamus merrillianus Elmer（bayog）。研究以MRS培养基（de Man, Rogosa, and Sharpe，MRS）为空白，制备CFSs并进行乙酸乙酯液液萃取。采用UHPLC–Q-TOF-MS正离子数据依赖采集（data-dependent acquisition，DDA；Top 3 MS/MS）获取数据，使用MZmine处理，基于特征的分子网络（Feature-Based Molecular Networking，FBMN）经全球天然产物社会分子网络（Global Natural Products Social Molecular Networking，GNPS）和SIRIUS进行推定注释，使用MetaboAnalystR进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、随机森林多维标度（random forest-based multidimensional scaling，RF-MDS）、变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）和方差分析，使用MetaboAnalyst 6.0进行通路富集，并使用BlastKOALA与KBase通量平衡分析（flux balance analysis，FBA）进行功能基因组和代谢网络分析。

研究结果：

3.1 本土菌株与阴性对照MRS的CFSs代谢谱主成分分析
通过非靶向LC–MS/QTOF分析乙酸乙酯部分，数据预处理后得到133个特征，代表胞外代谢组的半极性部分。PCA得分图解释58.3%总方差（PC1为36.4%，PC2为21.9%）。三个细菌组与未接种MRS对照空间分离，且细菌组之间也存在分离，表明所研究菌株具有不同的胞外代谢组谱。L. fermentum PJG11在生物学重复间表现出较大组内变异。合并质量控制样本紧密聚类，支持数据集的分析稳定性。

3.2 差异丰度分析
通过火山图和HCA比较细菌培养物与MRS。L. hilgardii DSB22相对MRS表现出最多显著下调特征，共10个；L. paracasei 7060仅4个特征显著耗竭；L. fermentum PJG11无显著耗竭特征。所有菌株中一致富集5个特征，推定注释为L-谷氨酸、富马酸、吲哚-3-乳酸（indole-3-lactic acid，ILA）、perlolyrine和焦谷氨酰异亮氨酸（pyroglutamylisoleucine，PyroGlu-Ile）。L-谷氨酸和富马酸在MRS与细菌培养物中均检测到，但在细菌培养物提取物中相对丰度更高；ILA、perlolyrine和PyroGlu-Ile未在未接种MRS中检测到，却在细菌培养物中一致检测到。HCA显示，推定注释为二酮哌嗪（diketopiperazines，DKPs）的特征较普遍；部分推定注释为cyclo(Pro-Phe)、cyclo(Leu-Pro)、cyclo(Pro-Val)、cyclo(Ser-Leu)和cyclo(Ala-Leu)的特征在LAB培养物中富集；1-乙酰基-β-咔啉（1-acetyl-β-carboline，1-ABC）特征在各菌株中显著富集。DKP相关特征也在阴性对照中检测到，可能与MRS灭菌过程中线性肽前体受热诱导环化有关。

3.3 监督多元分析
通过PLS-DA和RF-MDS对背景过滤特征建模，评估菌株依赖性代谢变异。置换检验支持PLS-DA结果显著性（p < 0.01）；随机森林使用500棵树，袋外误差为6.7%。两个模型一致将L. paracasei 7060明显分群，与其它菌株分离；L. hilgardii DSB22和L. fermentum PJG11部分重叠。该重叠可能与其发酵代谢相似性有关，二者均归类为专性异型发酵LAB，主要使用磷酸葡糖酸途径进行己糖发酵。L. paracasei 7060为兼性异型发酵，根据底物和生长条件利用Embden–Meyerhof–Parnas途径和磷酸酮醇酶途径，这种代谢灵活性可能促成其胞外代谢物谱差异。代谢组分离伴随生长和酸化谱差异：L. paracasei 7060早期生长快、pH降低最大，20 h滴定酸度（titratable acidity，TA）最高为2.42%；L. fermentum PJG11和L. hilgardii DSB22酸度较低、酸化更渐进。48 h采样时，L. paracasei 7060活菌密度下降，L. fermentum PJG11接近生长平台，L. hilgardii DSB22接近最大活菌密度。VIP > 1的特征被视为判别特征，其中perlolyrine和1-ABC VIP得分最高，尤其在L. paracasei 7060中；L. fermentum PJG11的判别特征为亮氨酰脯氨酸（leucyl-proline），L. hilgardii DSB22为ILA。

3.4 通路富集与功能基因组学分析
通过L. fermentum PJG11功能基因组分析，756个唯一注释的KEGG直系同源（KEGG Orthology，KO）分配广泛分布于代谢、遗传信息处理和环境信息处理。代谢中，碳水化合物代谢占11.77%，氨基酸代谢占11.24%。通路富集分析以Lactiplantibacillus plantarum WCFS1京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）为参考库，识别13条相关通路；精氨酸生物合成和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢影响值最高，分别为0.048和0.32。这些关联主要由富马酸和L-谷氨酸驱动，二者在三个本土LAB菌株中相对MRS显著富集。FBA模型显示，L-天冬氨酸经天冬氨酸氨裂解酶（aspA，rxn00347）转化为富马酸和氨的正通量；gap-filled反应rxn00260耦合L-天冬氨酸与2-酮戊二酸形成L-谷氨酸和草酰乙酸。BlastKOALA分析还识别到参与富马酸和谷氨酸形成的KO分配：富马酸水合酶（FumC）提供富马酸–苹果酸可逆互变步骤，天冬酰胺合酶B（asnB）可在谷氨酰胺依赖性L-天冬酰胺合成中生成L-谷氨酸作为副产物。亮氨酰脯氨酸作为L. fermentum PJG11判别特征，其可能代谢背景涉及OppABCDF转运体摄取寡肽，随后胞内加工生成含X-Pro肽，X-Pro二肽基肽酶（PepX）为释放包括Leu-Pro在内的X-Pro二肽提供基因组支持。ILA在L. fermentum PJG11色氨酸衍生代谢物中检测到；典型ILA生物合成涉及L-色氨酸转氨为吲哚-3-丙酮酸（IPyA），再由芳香族氨基酸氨基转移酶（ArAT）和吲哚乳酸/苯基乳酸脱氢酶（FldH）还原为ILA。L. fermentum PJG11基因组未识别典型ArAT和FldH，但含PatA、HisC和LdhA/LDH的KO分配，可作为候选酶功能。β-咔啉方面，1-ABC对应信号在接种培养物和未接种MRS中均检测到；perlolyrine仅在细菌培养物中发现。二者均由L-色氨酸和活性羰基化合物形成，甲基乙二醛（MGO）先于1-ABC，3-脱氧葡糖酮（3-DG）参与perlolyrine形成。基于L. fermentum PJG11功能基因组，研究人员提出在高葡萄糖可利用条件下这些代谢中间体潜在可得性的背景：PJG11基因组编码葡萄糖激酶（glk），支持葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸（G₆P）；FBA模型中G₆P转化为果糖-6-磷酸（F₆P，rxn00558）及F₆P转化为果糖-1,6-二磷酸（F_1,6BP，rxn00551）为gap-filled反应，为葡萄糖来源碳进入糖酵解提供计算机模拟支持。3-DG可通过葡萄糖与赖氨酸经Schiff碱和Amadori中间体非酶糖化产生。糖酵解下游，磷酸二羟丙酮（DHAP）和甘油醛-3-磷酸（G3P）可由磷酸丙糖异构酶（tpiA）可逆互变。尽管有报道细菌可通过甲基乙二醛合酶（mgsA）由DHAP产生MGO，但mgsA未在PJG11基因组中识别，因而无该酶促路线的基因组证据；不过mgsA缺失不排除非酶MGO形成，因为三糖磷酸中间体在生理条件下可自发降解为MGO。总体而言，基因组和FBA结果为葡萄糖衍生中间体可得性及MGO和3-DG潜在形成提供合理背景，但并未证实这些反应在L. fermentum PJG11中发生，也未直接证明所提出的生化序列。1-ABC相关特征强度增加也可能反映细菌生长和酸化过程中培养基来源前体变化，因为1-ABC有报道可在灭菌MRS中非生物形成；perlolyrine也可在酸性加热条件下非生物形成，但其在本研究条件下对perlolyrine积累的贡献仍不确定，因为本研究中培养温度显著低于有利于该非生物反应的温度。尽管有报道在细菌系统中检测到perlolyrine，其酶促途径仍 largely unexplored。

讨论与结论部分总结：讨论强调，菌株代谢差异与发酵类型、生长和酸化特征有关；由于分离株来源不同植物，植物来源对代谢表型的影响不能排除，但研究未独立控制物种身份和植物来源，因此这些因素对观察到的代谢组差异的相对贡献无法确定。1-ABC在未接种MRS和细菌培养物中均检测到，不能明确归因于细菌生物合成；perlolyrine仅在细菌培养物中检测到，提示与细菌生长相关，但其具体来源仍未解决。基因组和FBA结果仅提供候选代谢背景，不能建立反应发生或直接证明生化序列。

研究结论翻译：对Lactobacillus paracasei 7060、Limosilactobacillus fermentum PJG11和Lentilactobacillus hilgardii DSB22的细胞游离上清液（CFSs）进行非靶向代谢组学，揭示了这些本土LAB分离株之间不同的胞外代谢组谱。若干推定注释为氨基酸衍生物、二酮哌嗪、有机酸和β-咔啉的特征在本土LAB菌株中富集。其中，L. paracasei 7060表现出最独特的代谢组谱，以推定归属于β-咔啉（包括perlolyrine和1-乙酰基-β-咔啉）的特征富集为特征。相反，L. hilgardii DSB22表现出MRS相关特征的广泛耗竭和吲哚-3-乳酸富集，而L. fermentum PJG11表现出肽相关特征富集，包括亮氨酰脯氨酸。在未接种MRS培养基和细菌培养物中均检测到1-乙酰基-β-咔啉，表明其丰度增加不能明确归因于细菌生物合成。相反，perlolyrine仅在细菌培养物中检测到，提示与细菌生长相关，尽管其具体来源仍未解决。总体而言，本研究提供了菲律宾本土LAB菌株的比较外代谢组学表征，并扩展了当前对LAB胞外代谢多样性的认识。研究结果进一步突出了此前报道不足的推定注释代谢物，包括perlolyrine和pyroglutamylisoleucine，作为靶向筛选和评估其后生元研究潜在相关性的候选物。