TGF-β1通过诱导DNA甲基化调控SOCS3表达参与声带成纤维细胞异常激活的机制研究

《World Journal of Otorhinolaryngology - Head and Neck Surgery》：TGF-β1 Induced Methylation to Regulate SOCS3 Expression in Abnormal Activation of Vocal Fold Fibroblasts

摘要专业翻译 目的：探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）对声带成纤维细胞（VFFs）表型及DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达的影响，揭示TGF-β1调控SOCS3的潜在机制及其在声带损伤后VFFs异常激活中的可能作用。 方法：设立正常VFFs组（Control）、损伤VFFs组（Injured）、正常VFFs+TGF-β1组（Control+TGF-β1）和损伤VFFs+TGF-β1组（Injured+TGF-β1），并加入5-氮杂胞苷（5-aza）——一种通过共价捕获和降解降低DNMT1蛋白水平的DNA甲基转移酶抑制剂——以阻断DNA甲基化。采用甲基化特异性PCR（MSP）检测SOCS3启动子甲基化水平。在加入TGF-β1和5-aza前后，分别检测SOCS3启动子甲基化水平，以及I型胶原蛋白（COL1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、DNMT1、SOCS3、JAK2和STAT3的蛋白及mRNA表达。 结果：与Control组相比，Injured、Control+TGF-β1和Injured+TGF-β1组中COL1、α-SMA和DNMT1的表达均升高。加入5-aza后，Control组无显著变化；但Injured、Control+TGF-β1和Injured+TGF-β1组中上述标志物显著降低。Injured、Control+TGF-β1和Injured+TGF-β1组中SOCS3启动子甲基化水平显著升高，SOCS3表达显著下调，而Control组SOCS3启动子无明显甲基化。加入5-aza后，Injured、Control+TGF-β1和Injured+TGF-β1组中SOCS3启动子甲基化水平显著降低，同时SOCS3 mRNA和蛋白表达显著上调。Injured、Control+TGF-β1和Injured+TGF-β1组中JAK2和STAT3表达显著升高，而加入5-aza后显著降低，其变化与SOCS3上调呈正相关。 结论：研究人员提出TGF-β1可促进VFFs的异常激活，这可能与DNA甲基化介导的SOCS3调控有关。具体而言，TGF-β1可能通过DNMT1介导的启动子DNA甲基化下调SOCS3表达，该过程推测通过解除SOCS3对JAK2/STAT3信号通路的抑制作用而参与VFFs的异常激活。

论文解读

一、研究背景与科学问题

声带损伤后的纤维化与瘢痕形成是导致嗓音功能障碍的重要原因。声带成纤维细胞（vocal fold fibroblasts, VFFs）在炎症和创伤刺激下发生异常激活，细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度沉积，进而导致声带纤维化和瘢痕形成。肌成纤维细胞（myofibroblasts）是成纤维细胞的一种特殊亚型，在伤口愈合的 remodeling 阶段影响 ECM 蛋白的生成与重排，正常情况下通过凋亡机制在组织修复过程中消失，但在肝、肾、肺等多种器官中可导致纤维化病变。因此，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的异常转化是防治异常纤维化的关键。

转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）被认为是成纤维细胞异常激活的核心介质。在损伤修复研究中，TGF-β1在靶器官遭受创伤和炎症时被激活，通过信号转导调控细胞转化、增殖和凋亡，在ECM合成和伤口修复中发挥重要作用。已有研究表明，外源性TGF-β1刺激的VFFs具有与声带瘢痕成纤维细胞相似的细胞表型。JAK/STAT信号通路是多种细胞因子和生长因子信号传导的共同通路，作为TGF-β1的上游通路，可与TGF-β1相互作用参与纤维化过程。细胞因子信号传导抑制蛋白SOCS3能够抑制多种细胞因子的信号通路，是JAK/STAT信号通路的关键负性调控因子。在皮肤纤维化中，SOCS3表达下调，JAK2/STAT3信号通路被激活，SOCS3的失活可降低STAT3激活阈值并激活STAT3，可能直接促进成纤维细胞的自主激活。

表观遗传调控是一种不改变靶基因DNA序列即可修饰基因表达的方法。DNA甲基化被广泛用于肿瘤、发育和细胞分化研究。已有报道称TGF-β1可通过表观遗传调控调节DNA甲基转移酶的表达，改变下游基因的甲基化水平，进而影响相关基因表达，可能调控成纤维细胞激活。然而，TGF-β1对SOCS3的调控机制及其在VFFs异常激活过程中对纤维化的影响尚不清楚。本研究旨在体外探讨TGF-β1对VFFs表型及DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达的影响，揭示TGF-β1调控SOCS3的潜在机制及其在声带损伤后VFFs异常激活中的可能作用。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员建立大鼠声带损伤模型，取正常及损伤后声带组织进行原代VFFs培养。实验设置四组基础分组：Control（正常VFFs）、Injured（损伤VFFs）、Control+TGF-β1（正常VFFs加外源性TGF-β1）、Injured+TGF-β1（损伤VFFs加外源性TGF-β1），并在各组基础上加入5-aza（DNA甲基转移酶抑制剂）形成甲基化抑制组。主要技术方法包括：免疫组织化学（IHC）检测组织中TGF-β1、COL1、DNMT1、α-SMA和SOCS3的表达；细胞免疫荧光染色检测COL1和α-SMA的表达；Western blot检测DNMT1、SOCS3、JAK2、STAT3及其磷酸化蛋白水平；qRT-PCR检测COL1、α-SMA、DNMT1、SOCS3、JAK2、STAT3的mRNA水平；甲基化特异性PCR（MSP）检测SOCS3启动子甲基化水平。

三、研究结果

3.1 TGF-β1和DNMT1均影响VFFs的表型

通过免疫组化、细胞免疫荧光、Western blot和qRT-PCR检测发现，与Control组相比，Injured组中TGF-β1表达显著升高。在Injured、Control+TGF-β1和Injured+TGF-β1组中，COL1和α-SMA的蛋白及mRNA表达均显著高于Control组，且TGF-β1处理组的表达高于Injured组。DNMT1的蛋白和mRNA表达在三个激活组中均显著上调，且TGF-β1水平与DNMT1表达呈显著正相关。加入5-aza后，Control组中DNMT1和纤维化标志物无显著变化，而Injured、Control+TGF-β1和Injured+TGF-β1组中DNMT1表达显著降低，同时COL1和α-SMA的表达也显著下降，DNMT1的下调与纤维化标志物的减少呈正相关。这些结果表明声带损伤和TGF-β1以渐进方式促进VFFs激活，TGF-β1可能是DNMT1的上游调控因子，抑制甲基化可显著抑制成纤维细胞的激活表型。

3.2 TGF-β1被推测通过诱导启动子甲基化调控SOCS3表达

通过qRT-PCR、Western blot和MSP检测发现，SOCS3的mRNA和蛋白在Injured、Control+TGF-β1和Injured+TGF-β1三个激活组中均显著低于Control组。MSP结果显示，Control组中SOCS3启动子无明显甲基化，而三个激活组中SOCS3启动子甲基化水平显著升高。加入5-aza后，三个激活组中SOCS3启动子甲基化水平显著降低，同时SOCS3的mRNA和蛋白表达显著上调。值得注意的是，5-aza对正常VFFs和激活VFFs的作用存在差异：在正常Control组中，5-aza未改变COL1和α-SMA水平，但SOCS3 mRNA轻度降低，这可能与生理状态下SOCS3启动子存在轻度基础甲基化以维持细胞因子稳态有关；而在激活组中，5-aza显著缓解了由DNMT1升高导致的SOCS3启动子过度甲基化并恢复SOCS3转录。这些结果表明损伤和TGF-β1刺激可能通过诱导SOCS3启动子甲基化来抑制SOCS3表达，而抑制甲基化可逆转这一过程并恢复SOCS3表达。

3.3 TGF-β1诱导的甲基化被推测通过JAK2/STAT3通路调控SOCS3表达参与VFFs异常激活

通过Western blot和qRT-PCR检测发现，与Control组相比，Injured、Control+TGF-β1和Injured+TGF-β1组中JAK2和STAT3的蛋白及mRNA水平以及磷酸化水平均显著升高，且这种激活与SOCS3的下调密切相关。加入5-aza后，JAK2和STAT3的表达及磷酸化水平显著降低，这一抑制与SOCS3表达的恢复和VFFs纤维化表型的逆转同步发生。这些结果提示TGF-β1可能通过甲基化抑制SOCS3表达，从而解除SOCS3对JAK2/STAT3的抑制作用并激活该信号通路，推测参与VFFs的异常激活。

四、讨论与结论

在讨论部分，研究人员指出TGF-β1在肺、肝、肾、皮肤等多种组织和器官纤维化中被认为是促进成纤维细胞激活的核心介质。本研究发现TGF-β1与DNMT1表达呈显著正相关，与肺纤维化和肾纤维化中的发现一致，支持TGF-β1是VFFs异常激活中DNMT1的推定上游调控因子。多项其他组织纤维化研究也证实了DNMT抑制剂或siRNA可有效抑制纤维化的发生和发展。本研究中5-aza通过降低DNMT1蛋白水平显著下调COL1和α-SMA表达，且对正常VFFs无显著影响，提示5-aza在VFFs中的抗纤维化作用主要通过DNMT1降解介导。SOCS3作为细胞信号转导的负调控因子，在多种纤维化疾病中受到关注。本研究中SOCS3在激活组中显著降低，其启动子甲基化水平显著升高，5-aza处理后SOCS3表达恢复，表明TGF-β1可能通过诱导SOCS3启动子甲基化抑制其表达。SOCS3是JAK2/STAT3信号通路的关键调控因子，本研究中激活组JAK2/STAT3表达和磷酸化水平升高，5-aza处理后显著抑制，与SOCS3表达恢复同步。研究人员推测TGF-β1通过DNMT1介导的启动子DNA甲基化下调SOCS3表达，解除SOCS3对JAK2/STAT3信号通路的抑制作用，激活该通路，参与声带损伤后成纤维细胞的异常激活。

研究结论：声带损伤可激活TGF-β1表达。基于分子变化的同步性和与经典信号通路的一致性，研究人员推测TGF-β1通过DNMT1介导的启动子DNA甲基化下调SOCS3表达，从而解除SOCS3对JAK2/STAT3信号通路的抑制作用并激活该通路。这一调控过程被提出参与声带损伤后成纤维细胞的异常激活，为声带纤维化的干预提供了潜在的表观遗传学靶点。