过氧化氢在生理与疾病中的传感与信号传导：对治疗的启示

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Hydrogen peroxide sensing and signaling in physiology and disease: implications for therapy

　　

自由基是在需氧生物中普遍存在的高活性分子。其中，氧自由基如超氧化物（O2•-）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（OH•），统称为活性氧物种（ROS），引起了生命科学和生物医学领域研究者最多的关注，因为它们是需氧代谢的副产物，也是哺乳动物细胞所承受氧化负担的原因。然而，现在已知这种氧化应激仅在细胞被ROS淹没时发生，而受控的自由基产生爆发则协调着对机体健康至关重要的信号通路。像H2O2这样的ROS如今已被充分确认为第二信使，它通过蛋白质硫开关传递信号，从而激活细胞应激应对策略，并诱导参与增殖、生长和发育的通路。此外，这些氧化还原系统的缺陷被发现与许多疾病相关，这促使了新的治疗方式的开发，用于治疗和预防各种疾病。在这篇综述中，研究人员将讨论氧化还原生物学与医学领域的历史，以及这些发现如何导致了细胞内三种已知H2O2信号通路的发现：即水闸门机制、氧化还原接力机制和S-谷胱甘肽化信号机制。利用这些信息以及通过先进的分子生物学技术获得的、量化了H2O2在细胞内传播距离的新发现，研究人员随后提出，细胞利用这三种氧化还原信号机制来感知并在哺乳动物细胞内的短距离和长距离上传递H2O2信号。

引言

氧化还原生物学与医学领域在过去20年中取得了显著进展。氧化还原生物学是研究还原-氧化（redox）反应以及电子在供体和受体分子之间的移动如何调节细胞功能的学科。氧化还原医学指的是如何维持细胞氧化还原稳态可用于预防或治疗疾病。过氧化氢（H₂O₂）是该领域的核心分子，因为这种由哺乳动物细胞产生的普遍存在的非自由基氧化剂被用于协调许多生理功能。H₂O₂通过诱导蛋白质半胱氨酸硫的可逆氧化来传递信号，进而激活参与生长、发育和增殖的细胞通路。由H₂O₂引发的氧化还原信号通路对于协调细胞应激反应也至关重要，包括未折叠蛋白反应（UPR）、亲电应激反应（ESR）、热休克反应（HSR）、缺氧因子反应（HFR）、DNA损伤反应（DDR）和整合应激反应（ISR），所有这些共同构成了细胞应激调控子。这个细胞应激调控子也受钙（Ca）信号控制，钙信号在调节H₂O₂可用性方面也起着重要作用。H₂O₂和Ca共同作用来调节细胞应激调控子，以重建细胞稳态或促进应变稳态。

新的定量工具利用复杂的生物化学和分子生物学技术，极大地增进了我们对细胞H₂O₂稳态及其在氧化还原信号中作用的了解。这些新工具也拓宽了我们对H₂O₂在各种代谢疾病、炎症和癌症中作用的视角。例如，在癌症的情况下，现在了解到H₂O₂的产生并维持在高于正常细胞的水平，以促进癌细胞的转化、过度增殖、存活和转移。这是通过一些癌症显著改变氧化还原应激阈值来实现的，即增加几种抗氧化防御酶的表达，从而促进对氧化性窘迫的更高耐受性。总的来说，这种对健康和疾病背景下细胞氧化还原稳态动力学的更深入理解，极大地扩展了可用于治疗和/或预防各种疾病的治疗方式，以及哪些氧化性窘迫生物标志物可用于追踪疾病的进展和治疗效果。

关于细胞H₂O₂管理的开创性研究始于1900年，当时Loew证明了H₂O₂可被过氧化氢酶中和。Chance于1952年发现H₂O₂是呼吸作用的副产物。随后，在1956年，Dehnam Harman提出了“自由基衰老理论”。大约在同一时间，Mills发现红细胞利用谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）和还原型谷胱甘肽（GSH）来降解H₂O₂。过氧化物还蛋白（Prx）在H₂O₂降解中的作用直到1990年才完全阐明。同时发现硫氧还蛋白（Trx）是维持Prx催化活性所必需的。Trx最初被发现是核糖核苷酸还原酶（RNR）的氢供体，后来被发现能催化多种二硫化物的还原。Trx的结构最初在大肠杆菌中被鉴定，并包含一个催化二硫键交换反应所必需的活性位点-CGPC-基序。超氧化物歧化酶（SOD）能将超氧化物（O₂^•-）歧化为H₂O₂，由McCord和Fridovich于1969年发现。抗坏血酸、α-生育酚、多酚和类黄酮也与SOD、过氧化氢酶、Gpx和Prx协同作用以淬灭自由基。Sies随后在1985年创造了术语“氧化应激”。

Holmgren发现的-CXXC-基序是氧化还原生物学领域的一个关键里程碑，因为它被发现在整个自然界中是保守的，并被原核生物和真核生物用于驱动抗氧化防御、蛋白质折叠、氧化还原调节和细胞信号传导所需的二硫键交换反应。属于Trx超家族的蛋白质包括二硫键异构酶和氧化还原蛋白，如谷氧还蛋白（Glrx）。Glrx蛋白也被发现是RNR的氢供体，但后来被发现对于通过可逆的蛋白质S-谷胱甘肽化（PSSG）反应调节细胞功能以及铁硫簇的生物合成很重要。Trx现在被认为通过所谓的氧化还原接力系统在响应生理信号的细胞信号介导中发挥核心作用，其中信号通过Trx和目标蛋白之间的二硫键交换反应进行传播。

S-谷胱甘肽化是一种古老的修饰，因为在1921年就有人提出谷胱甘肽可以与蛋白质硫形成稳定的加合物。直到后来，Sies报道了百草枯会增加灌注大鼠肝脏中的PSSG加合物。1983年，Mannervik和Axelsson发现S-谷胱甘肽化保护兔肝丙酮酸激酶免于氧化失活，并且该反应由一种巯基氧化还原酶介导，后来被鉴定为谷氧还蛋白-1（Glrx1）。Sies随后提出PSSG加合物的形成是保护蛋白质硫免于不可逆氧化成亚磺酸和磺酸所必需的。从这些发现中，后来发现肌酸激酶、糖原磷酸化酶b和碳酸酐酶III会形成PSSG加合物，这些加合物可被Glrx1逆转。重要的是，1987年还发现PSSG加合物的形成可由激素的代谢信号诱导，这连同先前描述的观察结果，提供了S-谷胱肽化信号机制的一些最早证据。后来，发现肌动蛋白丝动力学受到表皮生长因子诱导的、由Glrx1介导的G-肌动蛋白可逆S-谷胱甘肽化的调节，这进而导致发现胞质S-谷胱甘肽化反应的破坏与神经疾病有关。Glrx2是Glrx1的线粒体同工酶，于21世纪初被发现，对心脏和眼睛功能至关重要。S-谷胱甘肽化信号机制现在被认为是一种普遍的氧化还原修饰，需要用来控制细胞对GSH池氧化还原状态的响应。

这些氧化还原生物学与医学的先驱为我们目前理解哺乳动物细胞如何接收和传递H₂O₂信号奠定了基础。然而，关于H₂O₂信号如何在亚细胞水平被感知然后被释放以调节细胞功能，仍然存在重大问题。

氧化应激：欣力应激与窘迫应激

目前，H₂O₂在调节哺乳动物细胞功能中的生物学作用是毋庸置疑的，但在40多年前，显示其发挥信号作用的关键发现基本上未被注意到。自由基可能被产生以满足生理功能的第一个证据可以追溯到1933年，当时Baldridge和Gerard观察到白细胞吞噬病原体时的“呼吸爆发”。这导致NADPH氧化酶（NOX）被确定为中性粒细胞中杀死被吞噬病原体所需的氧化爆发的酶。H₂O₂在细胞信号传导中的作用在20世纪70年代变得明显，当时发现它可以模拟胰岛素信号并激活鸟苷酸环化酶。之后，研究表明微摩尔水平的H₂O₂通过鸟苷酸环化酶激活诱导动脉肺松弛。此外，H₂O₂通过酪氨酸激酶磷酸化诱导了拟胰岛素效应。随后发现核因子kappa B（NFκB）是一种在人免疫缺陷病毒感染的T细胞系中由氧化还原激活的转录因子。然后，在1991年，发现非吞噬细胞也含有NOX的同工型。这一发现的生物学意义直到后来才发现，血小板衍生生长因子、表皮生长因子、血管紧张素II、胰岛素和转化生长因子-β在非吞噬细胞中的促有丝分裂功能部分是通过诱导水闸门信号机制介导的，该机制涉及NOX增加H₂O₂的产生。H₂O₂的信号功能直到发现缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和核因子E2相关因子2（NRF2）这两个对触发细胞应激适应性反应至关重要的转录因子被H₂O₂激活后才被广泛接受。

欣力应激与窘迫应激的定义

将H₂O₂视为信号分子使其与氧化应激的定义相矛盾。这是因为氧化应激这个术语过去和现在都被用来描述H₂O₂在哺乳动物细胞中的正面和负面影响。为了避免文献中更多的混淆，Sies、Berndt和Jones提出了两个新术语来解释哺乳动物细胞与H₂O₂的二元关系：氧化性欣力应激和氧化性窘迫应激。氧化性欣力应激指的是一种积极的氧化应激状态，其中H₂O₂诱导蛋白质硫的位点特异性氧化，通过激活信号通路引起细胞行为的改变。氧化性欣力应激通路涵盖了整个H₂O₂相互作用组或氧化还原组，并作为暴露组与基因组、表观基因组、蛋白质组和代谢组之间的界面，以引发细胞应激反应、生长、增殖和分化或细胞死亡。根据计算，估计氧化性欣力应激是由浓度低于100 nM的H₂O₂触发的。此外，氧化性欣力应激信号通过位点特异性蛋白质硫氧化的传播取决于：1. 巯基的反应性和蛋白质中反应性巯基的数量；2. 反应性巯基与H₂O₂来源的接近程度；3. 细胞或亚细胞H₂O₂浓度，这通过其产生和降解来控制；4. H₂O₂中和系统的亚细胞反应性、效率和丰度。相比之下，氧化性窘迫应激被确定发生在H₂O₂浓度大于100 nM时，由于蛋白质硫的非特异性和不可逆氧化而导致功能失调的氧化还原信号。因此，为了从H₂O₂中获益，哺乳动物细胞必须通过调节其产生和促进其被抗氧化剂中和来严格控制其可用性，以避免其有害影响。

巯基的反应性

H₂O₂对巯基的氧化与细胞H₂O₂的来源

蛋白质半胱氨酸对H₂O₂的反应性取决于其pKa。半胱氨酸硫在其质子化状态下反应性较弱，而电离成硫醇阴离子则形成强亲核试剂，能与H₂O₂快速反应。半胱氨酸硫的pKa约为8.25，但细胞微环境可以显著降低这个pKa。pKa降低可能是由于蛋白质微环境、pH波动或氧化还原环境造成的。例如，GSH中半胱氨酸的pKa约为8.5，这将其与H₂O₂的反应速率限制在约0.87 M^?1 s^?1。相比之下，Prx中过氧化半胱氨酸的pKa约为5-6，使得H₂O₂的中和速率达到10⁵-10⁷ M^?1 s^?1。细胞中有几种蛋白质使用反应性半胱氨酸来感知H₂O₂。哺乳动物细胞中的典型例子是Kelch样ECH相关蛋白1（KEAP1），它分别使用Cys151、Cys273和Cys288与H₂O₂反应以促进NRF2稳定化。另一个例子是在水闸门信号机制中，H₂O₂使蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）失活。PTP利用其活性位点催化半胱氨酸水解有丝分裂原激活蛋白上的磷酸盐，从而使有丝分裂和胰岛素信号脱敏。在水闸门信号机制中，来自生长因子的有丝分裂信号通过NOX增加H₂O₂的产生而被延长。这导致Prx的暂时氧化失活，导致H₂O₂积累并抑制PTP。现在公认氧化性欣力应激信号是通过KEAP1和PTP等传感器蛋白传播的。然而，关于H₂O₂信号如何通过这些传感器传递仍然存在重要问题。PTP半胱氨酸与H₂O₂反应的速率常数估计为20 M^?1 s^?1，需要9.6 μM H₂O₂才能在1小时内产生响应。KEAP1预计与H₂O₂具有相似的反应动力学。至关重要的是，这些H₂O₂浓度会诱发氧化性窘迫应激，而非欣力应激。此外，抗氧化防御对H₂O₂的中和速率常数比其与PTP和KEAP1中半胱氨酸传感器的反应速率常数大5-7个数量级。这意味着H₂O₂从其产生源扩散将限制其与PTP和KEAP1的反应。那么PTP和KEAP1是如何感知H₂O₂的呢？最近使用实时H₂O₂报告基因HyPer7在培养细胞线粒体基质、膜间隙和外膜以及细胞质和核腔中的表达证实了这一预测。很可能KEAP1和PTP等氧化还原传感器是与紧邻反应性半胱氨酸处产生的H₂O₂发生反应。例如，Saeedi Saravi等人最近证明，H₂O₂的信号结果取决于其产生的细胞位置。使用靶向不同亚细胞环境的HyPer 7.2，作者表明细胞外H₂O₂对内皮细胞磷酸化级联反应的影响很小，但细胞质中D-氨基酸氧化酶介导的H₂O₂生成则诱导了内皮一氧化氮合酶（eNOS）、PKB和AMP依赖性激酶（AMPK）磷酸化的显著增加。总的来说，这些发现表明H₂O₂的亚细胞位置对细胞信号传导结果有显著影响。

细胞已被记录含有超过60种位于质膜、细胞质、细胞核、过氧化物酶体、线粒体、内质网、溶酶体和内涵体的O₂^•-和/或H₂O₂发生器。对细胞ROS总量贡献的主要因素取决于几个因素，如细胞类型、生理和环境刺激、营养状况、分子氧水平、毒素的存在等等。仅线粒体中就有12种O₂^•-和/或H₂O₂发生器，线粒体可占O₂^•-/H₂O₂的90%，但这并非所有细胞都普遍如此。事实上，正如Sies等人所证明的，细胞ROS产生的格局非常复杂。NOX占培养C2C12成肌细胞中O₂^•-的40%，而复合物I和III分别占15%和30%。NOX也被认为是许多其他细胞类型中O₂^•-的主要来源。NOX是内皮细胞中重要的ROS来源，但当eNOS与其产生一氧化氮的能力解偶联时，eNOS本身也是如此。eNOS解偶联通常被视为与氧化性窘迫应激相关，并参与动脉粥样硬化和心血管疾病的发病机制。核质中ROS源（如赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）和精胺氧化酶（SMOX））在激活细胞应激信号通路中的作用将在下文详细讨论。关于LSD1和SMOX在氧化还原信号中的作用知之甚少，但最近的研究支持它们在促进细胞应激应对策略（如DNA损伤反应）诱导中的作用。图3中突出了不同亚细胞环境中其他重要的细胞ROS发生器，并在别处进行了描述。综上所述，哺乳动物细胞配备了许多H₂O₂生产者，这使得H₂O₂很可能可以在紧邻传感器的位置产生。此外，膜接触位点也可能通过允许通过次磺酸形成进行有效的H₂O₂感知，在细胞器间氧化还原串扰中发挥作用。一些H₂O₂发生器，如NOX，是可移动的，可以被包装在称为氧化还原小体的囊泡中，用于分泌和递送至邻近细胞。总之，这些因素可能允许H₂O₂生产者足够接近传感器蛋白中的半胱氨酸巯基，从而激活氧化还原信号。

可氧化半胱氨酸与氧化形式

蛋白质也可以拥有不止一个可氧化半胱氨酸，这增加了氧化性欣力应激信号如何传播的复杂性。使用年轻和年老小鼠进行的体内可氧化半胱氨酸的综合氧化还原组学分析揭示了约9400种蛋白质中约有34,000个可氧化半胱氨酸。结合半胱氨酸的可变反应性，这意味着可氧化半胱氨酸在细胞中无处不在，并且蛋白质可以根据可氧化半胱氨酸/蛋白质的数量采用不同的可氧化形式，这可能对氧化性欣力应激信号的传递产生深远影响。例如，假设半胱氨酸可以有两种氧化状态，Cobley提出，具有三个可氧化半胱氨酸的蛋白质可能潜在地采用八种不同的氧化还原状态，这可能显著影响细胞的氧化还原特征。由此可以推断，由于这种氧化形式异质性，细胞可以采用不同的氧化还原特征，这些特征受到H₂O₂产生和中和速率、H₂O₂生成的亚细胞位置以及各个巯基反应性的影响。使这种复杂性进一步增加的是，半胱氨酸硫可以有多种氧化状态，因此可以进行多种类型的可逆氧化。

H₂O₂可用性的调节

细胞H₂O₂的量由其产生速率和降解速率控制。这些因素最终决定了H₂O₂信号的强度和持续时间。如上所述，H₂O₂被由NADPH驱动的几种抗氧化系统中和。值得注意的是，正是抗氧化池的氧化，特别是GSH和Trx系统，使得H₂O₂水平在氧化性欣力应激信号开始时能够在细胞中积累。例如，如概述所示，延长有丝分裂反应的生长因子诱导的H₂O₂信号首先需要Prx池的氧化。Prx是一个同源二聚体，使用过氧化半胱氨酸来中和H₂O₂。这形成了次磺酸，它与解析半胱氨酸反应，形成使Prx蛋白失活的二硫键。二硫键随后被Trx和NADPH还原。在水闸门信号模型中，NOX增加的H₂O₂产生促进了Prx中次磺酸进一步氧化为亚磺酸。尽管亚磺酸被硫氧还蛋白还原酶（Srx）在ATP存在下解析，但该反应动力学缓慢，这使得H₂O₂能够积累以诱导氧化性欣力应激。

氧化还原信号也受到控制H₂O₂产生速率的因素的调节，这与各个酶的活性相关。最终，酶产生H₂O₂受量子力学现象“电子隧穿”的支配。因此，控制电子供体和受体可用性或阻断电子流的因素可以在决定H₂O₂产生速率方面发挥重要作用。例如，像S-谷胱甘肽化和S-亚硝基化这样的氧化还原修饰显著降低了多种线粒体酶（如α-酮戊二酸脱氢酶（KGDH）、丙酮酸脱氢酶（PDH）和复合物I）的H₂O₂产生速率。在S-谷胱甘肽化的情况下，当GSH池被H₂O₂氧化时，谷胱甘肽基团会加到半胱氨酸上。这些反应由线粒体基质中的Glrx2驱动，并阻断了KGDH、PDH和复合物I产生H₂O₂。