《Applied Biological Chemistry》：RFID-based assessment of sublethal effects of fenobucarb and carbendazim on honey bee homing flight
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评估农药对蜜蜂（Apis mellifera）的亚致死行为效应是蜜蜂风险评估的关键组成部分。本研究旨在优化基于射频识别（RFID）跟踪的实验条件，并评估仲丁威（FNC）和多菌灵（CBZ）对蜜蜂归巢表现的亚致死效应。研究人员将单独标记的采集蜂暴露于亚致死剂量的F
评估农药对蜜蜂（Apis mellifera）的亚致死行为效应是蜜蜂风险评估的关键组成部分。本研究旨在优化基于射频识别（RFID）跟踪的实验条件，并评估仲丁威（FNC）和多菌灵（CBZ）对蜜蜂归巢表现的亚致死效应。研究人员将单独标记的采集蜂暴露于亚致死剂量的FNC（0.00025和0.0025 μg/只）或CBZ（0.005和0.05 μg/只），并监测24小时。通过蜂箱入口处的RFID检测，量化了包括回巢率、首次回巢时间和离巢次数在内的行为终点。对照组和溶剂对照组的回巢率均较高（> 90%）且相当，表明基线归巢表现良好，且溶剂暴露无明显影响。与溶剂暴露相比，两种剂量的FNC暴露均未显著影响归巢成功率、中位回巢时间或离巢次数。在低剂量下，CBZ暴露显著降低了回巢率；然而，在高剂量下未观察到这种效应，且未伴随中位回巢时间或离巢次数的变化，表明缺乏一致或剂量依赖性的行为反应。综合考虑各行为终点的整体模式，在本研究条件下，两种物质均未对归巢相关行为产生一致的不利影响。总体而言，优化的RFID方法为蜜蜂亚致死行为表现提供了稳定可靠的测量。
研究背景与科学问题
蜜蜂（Apis mellifera）作为关键传粉者，对农业生产力和生态系统稳定性至关重要。然而，它们在采食过程中不可避免地会接触农药。尽管这些物质可能不会立即导致蜜蜂死亡，但常会诱发导航、采食偏好和归巢表现等方面的亚致死损伤，从而削弱传粉效率并威胁蜂群长期存活力。传统的行为评估方法存在劳动强度大、观测窗口短、个体追踪能力有限等局限，难以检测低剂量农药暴露引发的细微或延迟效应。射频识别（RFID）技术能够实现近场条件下连续、非侵入性的个体活动监测，已被用于量化蜜蜂的离巢行为及评估冷暴露、二氧化碳麻醉等胁迫因素。此前，RFID技术也已成功应用于评估多种农药对蜜蜂归巢行为的影响。然而，对于广泛使用的氨基甲酸酯类杀虫剂仲丁威（FNC）和苯并咪唑类杀菌剂多菌灵（CBZ），其在田间相关条件下对蜜蜂归巢行为的亚致死效应研究仍十分有限。因此，本研究旨在优化基于RFID的行为评估实验流程，并利用高精度个体追踪系统评价FNC和CBZ对意大利蜜蜂（A. mellifera）归巢表现的短期亚致死效应。
研究方法与技术手段
研究人员采用了多项关键技术方法：首先，使用真空辅助收集装置在蜂箱入口处捕获携带花粉的采集蜂，并通过荧光颜料标记和1公里外释放筛选30分钟内成功返巢的健壮个体。其次，为每只合格采集蜂的胸部背板粘贴微型RFID芯片（mic3-TAG 16k，1.6 mm × 1.9 mm × 0.5 mm，约5.4 mg），并使用牙科水泥固定。第三，采用群体饲喂法，通过宽口移液器吸头向每组10只蜜蜂提供200 μL含特定浓度农药的30%（w/v）蔗糖溶液进行口服暴露。第四，在蜂箱入口安装iID MAJA读取器模块4.1，自动记录24小时内进入蜂箱蜜蜂的唯一识别码（UID）和时间戳。实验共进行三次独立重复，每次使用不同蜂群，共计180只RFID标记的采集蜂。数据统计分析采用Kruskal-Wallis检验结合Dunn多重比较检验，并以溶剂对照组为参照。
研究结果
实验设置与优化：
研究人员优化了整个实验工作流程。通过真空辅助装置快速捕获大量采集蜂，并在确认阶段确保只有30分钟内成功返巢的健壮个体被选入后续实验。改进的捕捉系统（软管直径1.5 cm，收集盒容量限制）减少了处理应激。使用非粘性宽口移液器吸头确保了测试溶液的可靠递送。RFID标签附着使用女王蜂标记笼提高了效率。三次独立实验的结果显示，对照组和溶剂对照组的归巢成功率在实验间无显著差异（广义线性混合模型GLMM分析，似然比检验LRT：P > 0.05），返巢时间分布也无统计差异（Kruskal-Wallis检验，P > 0.05），证明优化后的工作流程具有良好的可重复性和稳定性。
测定灵敏度验证与农药暴露效应：
使用已知会损害蜜蜂归巢行为的噻虫嗪作为阳性对照物质进行验证测试。未经处理的对照组24小时回巢率为70.0%（21/30只），而暴露于噻虫嗪（1.5 ng/只）的蜜蜂回巢率显著降至26.67%（8/30只），证实了测试系统的灵敏度和可靠性。
随后，研究人员评估了FNC和CBZ的效应：
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回巢率：对照组（92.22 ± 2.22%）和溶剂对照组（91.94 ± 3.27%）的回巢率均超过90%，且无显著差异。FNC在两个剂量（0.00025和0.0025 μg/只）下的回巢率分别为88.52 ± 4.12%和90.00 ± 3.73%，与溶剂对照组相比无显著差异（P > 0.05）。CBZ在低剂量（0.005 μg/只）下显著降低了回巢率至75.71 ± 7.08%（P = 0.01），但在高剂量（0.05 μg/只）下回巢率为89.88 ± 1.67%，与溶剂对照组相当。
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返巢时间：所有处理组的中位返巢时间及其四分位数范围均与溶剂对照组（中位时间47.13分钟）有较大重叠，表明FNC和CBZ暴露未改变返巢时间分布。
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离巢次数：对照组（10.59 ± 0.56次）和溶剂对照组（10.81 ± 0.55次）的离巢次数相近。所有FNC和CBZ处理组的平均离巢次数均在溶剂对照组范围内（10.23 ± 0.54至11.91 ± 0.65次），无显著差异。
综合来看，FNC和CBZ暴露在本研究条件下未产生一致的剂量依赖性归巢行为变化。
讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究优化的工作流程有效减少了程序性干扰，对照组超过90%的高回巢率远高于经济合作与发展组织指导文件（OECD GD）规定的最低有效性标准（≥ 70%）。真空辅助采集、荧光颜料筛选健壮个体、以及使用标准化工具进行精确口服给药等改进措施，最大限度地减少了实验伪迹，保证了生态相关性。研究强调，尽管低剂量CBZ暴露导致回巢率统计学上的显著降低，但这种非单调的剂量反应（高剂量无效）缺乏生物稳健性和功能一致性，因为其并未伴随返巢时间或离巢次数的改变，且与CBZ作为微管组装抑制剂而非直接作用于神经通路的机制不符。因此，研究人员认为该发现需要独立验证。对于FNC，其乙酰胆碱酯酶抑制的作用模式可能需要达到更高程度的抑制才能产生可检测的行为效应，而本研究所用剂量可能不足以引发此类效应。
研究结论总结如下：本研究建立了一个优化的、基于RFID的监测平台，用于在田间相关条件下评估蜜蜂归巢表现。该平台产生了稳定、高分辨率的行为数据，并在多次独立试验中表现出一致性。应用该平台表明，急性暴露于FNC和CBZ未对归巢成功率、返巢时间或离巢次数产生一致或剂量依赖性的损伤。虽然0.005 μg/只的CBZ显著降低了回巢率，但这一低剂量响应在高剂量下未被观察到，属于非单调性发现，有待独立验证。多个归巢相关终点的整合支持了证据权重的解释，同时凸显了优化方法学在一致评估蜜蜂归巢行为中的价值。
