《European Journal of Human Genetics》：Optimized RNA-seq workflow for routine diagnosis of mitochondrial diseases using aberrant expression analysis and phenotype-driven prioritization
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线粒体疾病（mitochondrial diseases, MD）是最常见的遗传性代谢病，并表现出显著的临床和遗传异质性。尽管全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）和全基因组测序（whole-genome sequencing
线粒体疾病（mitochondrial diseases, MD）是最常见的遗传性代谢病，并表现出显著的临床和遗传异质性。尽管全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）和全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）已广泛使用，近半数患者仍缺乏分子诊断，部分原因在于解释影响RNA剪接或基因表达的变异存在困难。RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）在研究环境中已显示出前景，但很少有研究评估其在技术和经济限制下用于常规临床诊断的可行性。研究人员评估了将RNA-seq纳入MD常规诊断工作流的实施情况，使用来自38例患者的成纤维细胞，其中8例采用候选基因策略分析，30例采用非靶向策略。为优化工作流并提高非靶向分析灵敏度，研究人员聚焦于使用OUTRIDER进行异常表达（aberrant expression, AE）检测，并结合互补分析策略，包括限制于疾病相关基因集的多重检验校正，以及基于Z-score的离群值检测与使用Human Phenotype Ontology（HPO）术语的表型驱动优先级排序相结合。该联合策略在优化资源的同时，实现了与既往发表研究相当的诊断性能。在靶向病例中，75%（6/8）确认了致病性。在非靶向队列中，尽管样本量少于通常推荐数量并最小化了成本，仍在13%的患者（4/30）中建立了新的分子诊断。该研究表明，尽管存在分析和经济限制，RNA-seq在常规诊断环境中可行且具有临床信息价值。RNA-seq是WES/WGS的有价值补充，可改善MD中的变异解释和诊断产出。研究人员提出了一种在常规诊断中将其与基因组测序并行实施的实用框架。
研究背景：线粒体疾病（mitochondrial diseases, MD）是由线粒体呼吸链和ATP合酶功能障碍引起的罕见遗传病，是最常见的代谢病，估计患病率约为1/5000。MD可由线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）或核DNA（nuclear DNA, nDNA）变异引起，可累及所有器官，表现高度可变。其诊断复杂，依赖临床、影像、生化及组织病理学组合，但确定诊断需要基因检测。WES和WGS进入常规诊断后带来重要进展，法国MitoDiag推荐对疑似原发性线粒体病患者采用WES，法国基因组医学计划PFMG2025使WGS可及。然而，约半数疑似MD仍无分子诊断，主要挑战在于解释影响RNA剪接或基因表达的变异。在法国MD队列中，约30%携带致病核变异的患者存在功能丧失变异，包括11%剪接变异，其中三分之一位于经典剪接位点外。RNA-seq作为DNA与蛋白之间的中间层，可提供转录组范围信息，检测异常表达（aberrant expression, AE）、异常剪接（aberrant splicing, AS）和单等位表达（monoallelic expression, MAE）。自2017年首次诊断应用以来，RNA-seq在罕见病中诊断产出约10%–40%；在MD中，成纤维细胞RNA-seq使诊断产出提高10%–16%，AE是近期研究中诊断成功的主要贡献者，占诊断病例的78%。但RNA-seq在常规诊断实验室中的实施仍有限。本研究旨在评估在分析和经济限制下RNA-seq在诊断实验室中的可行性，并评估其与WES/WGS结果结合纳入诊断策略的潜力。研究人员分析了候选基因中意义未明变异（variants of uncertain significance, VUS）患者即“靶向方法”，以及无候选基因患者即“非靶向方法”；鉴于Yépez et al.报道的AE高诊断比例，非靶向策略围绕AE检测设计，并用互补优先级策略优化分析流程。该研究证明，尽管样本量少于通常推荐且测序深度限制为30 million reads以降低成本，RNA-seq对VUS解释和未解决患者候选基因识别仍有明确附加价值。
研究人员开展的研究：本研究队列来自Nice University Hospital线粒体疾病参考中心CALISSON，共38例疑似MD且经外显子测序后未诊断患者，分为两组。第1组“targeted RNA-seq”包括8例，携带常染色体隐性候选基因中感兴趣变异：5例双等位变异，3例单变异；纳入要求候选基因在GTEx数据库中表达（TPM > 5）。第2组“untargeted RNA-seq”包括30例有强临床怀疑但无候选基因者，其中10例来自近亲家庭。患者接受新的临床评估，部分病例行WGS。研究结论是RNA-seq在常规诊断中可行且有临床信息价值，可作为WES/WGS补充，改善MD变异解释和诊断产出；研究人员提出将其与基因组测序并行纳入常规诊断的实用框架。
关键技术方法概述（不超过250字）：队列来自Nice University Hospital线粒体疾病参考中心CALISSON，为WES后未诊断的38例疑似MD患者；第1组8例候选基因靶向，第2组30例非靶向，其中10例来自近亲家庭。主要方法为成纤维细胞短读长poly(A)链非特异RNA-seq，约30 million reads，Illumina NovaSeq X Plus平台，配对2 × 100 bp；STAR比对GRCh38，featureCounts定量。OUTRIDER检测AE，控制培养液、性别、年龄和批次，采用Benjamini–Hochberg（BH）与Benjamini–Yekutieli（BY）校正，并限制于OMIM、MitoCarta和PanelApp基因集。IGV结合Sashimi图和等位基因计数评估AS和MAE。RT-PCR/Sanger、SpliceAI/SPiP、minigene、puromycin treatment（PT）及WES/WGS用于验证。
研究结果：
RNA sequencing：共对第1组8例和第2组30例测序，每人一次RNA-seq，中位测序深度36 million reads（范围27–66 million reads）。主成分分析显示测序批次和培养液驱动强聚类，性别和年龄影响较小。OUTRIDER流程标准化跨批次基因表达，减少不需要的技术变异并改善异常表达基因检测。队列中13,281个基因以中位TPM > 1表达；394个线粒体基因中354个（89.8%）中位TPM > 1，311个（78.9%）中位TPM > 5；1136个MitoCarta基因中982个（86.44%）中位TPM > 1，844个（74.3%）中位TPM > 5；5020个OMIM基因中3257个（64.88%）中位TPM > 1，2612个（52.03%）中位TPM > 5。第1组“targeted RNA-seq”中，RNA-seq识别出与6个内含子变异相关的异常事件，确认其致病性并使这些患者获得明确分子诊断（75%，6/8，患者1、3、5、6、7和8）。值得注意的是，半数诱导AS的变异导致多个不同替代转录本。第2组“untargeted RNA-seq”中，基于AE离群值识别出4个候选基因；重分析RNA-seq、外显子组和基因组数据后确认4个新诊断（患者9–11和13），占该组13%（4/30）。关于异常基因表达，共3个基因显著低表达（adjusted p < 0.05）（患者7、10和11）；另有5个基因p < 0.05且Z-score < ?2（患者1、3、6、9、13），但校正后未达显著。
Group 1 “targeted RNA-seq”：第1组包括5例在临床相关常染色体隐性疾病基因中携带两个杂合变异者（患者1–5），以及3例携带单变异者，其中患者8变异已报道为致病，患者6–7高度怀疑致病。前5例均为一个错义变异和一个内含子变异复合杂合。患者2除AARS2变异外，HARS1中两个变异也有临床意义。6个内含子变异中，4个为VUS，2个为可能致病（likely pathogenic, LP）：MSTO1 c.220+5 G > C, p.?，依据家族共分离；MRPS22 c.648+1 G > T, p.?。尽管c.648+1 G > T影响共识供体剪接位点，但患者3表型未经典与MRPS22相关。4个VUS中，3个位于最小供体剪接区（+4或+5）（患者1、2和5），1个位于受体剪接区（?15）（患者2）。RNA-seq用于评估6个内含子变异的功能影响，患者5因死亡无法获得先证者成纤维细胞，改用母源成纤维细胞。为进一步研究AS，研究人员对患者2–4和7进行PT后RNA-seq，对患者1进行minigene assay。患者4此前已通过RT-PCR和Sanger测序发现MAE，直接进行PT后RNA-seq。RNA-seq在6例中识别异常事件：4个变异显著MAE（患者1、3、7和8），5例显著AS（患者5、6、8，以及患者3和7在PT后）。患者7中NDUFS1显著低表达（adjusted p < 0.05），患者1、3和6中p < 0.05且Z-score < ?2。RNA表达分析采用较宽松BH校正，因为OUTRIDER默认BY多重校正未识别任何显著AE事件。在第1组剩余3例（患者6–8）中，WES识别出感兴趣基因单变异；RNA-seq与WGS并行并进行临床再评估。RNA-seq在这3例均显示AS事件，确认可能存在WES未检出的第二变异；患者6和7需WGS精确表征第二致病变异。
Group 2 “untargeted RNA-seq”：第2组包括30例，其中10例来自近亲家庭，WES未识别候选基因。为识别致病基因，研究人员对全部30例进行RNA-seq和临床再评估，并对10例行WGS。使用BH校正的RNA表达分析在患者10和11中识别出两个显著异常基因（TOP3A和SLC25A26）。将分析限制于MitoCarta或线粒体基因panel集还识别出患者9中NARS2显著异常。此外，研究人员检查Z-score阈值?2的基因。总体应用该阈值时，全队列每例患者中位282个候选基因；限制于OMIM基因降至75个；进一步限制于MitoCarta基因降至22个（Z-score < ?2）。因此，将低表达基因（Z-score < ?2）与基于HPO的表型过滤结合是实用有效方法。研究人员据此在患者13中识别出额外候选基因UFM1。随后重分析RNA-seq、WES和WGS数据确认这4个新诊断，占该队列13%。
In silico predictions：研究数据确认SpliceAI评分超过0.5具有可靠性，许多致病或LP变异超过0.8的高特异性严格阈值（患者1、3、5–7）。SPiP可有效补充供体和受体区域变异预测，但对深内含子或启动子变异存在局限。预测与观察到的剪接常有差异，仅1例完全匹配。
讨论部分总结：本研究显示RNA-seq在靶向和非靶向分析中均可与常规诊断实践兼容。尽管RNA-seq可提高诊断产出，但其整合仍受技术经济限制，包括小队列、缺乏生物学重复和生物信息学专长有限。靶向分析中，研究人员通过MAE（4/8）或AS（5/8，包括2例PT后）证明致病效应，在75%（6/8）患者中确认诊断。6个确认的功能丧失变异中，4个与低表达相关（1个adjusted p < 0.05，3个Z-score < ?2）。非靶向分析聚焦AE，因为既往研究显示其高检出率，并且在小队列和降低测序深度下可靠检测剪接异常存在困难，原因包括无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated decay, NMD）或可及组织中基因低表达。通过结合敏感AE检测、限制基因集的多重检验校正（线粒体基因panel、MitoCarta和OMIM）及详细临床表型，研究人员识别4个候选基因；重分析RNA-seq、外显子组和基因组数据后获得4个新诊断（13%，4/30），与已发表约10%的产出一致。靶向方法中，候选基因方法历史上依赖RT-PCR验证疑似剪接缺陷，但VUS增加使该方法复杂化，因为计算机预测不总可靠并可能偏倚引物设计。SpliceAI和SPiP有效，但本队列预测与观察剪接常不一致，仅1个完全匹配；如患者2的AARS2变异，多种预测结果使cDNA Sanger测序设计复杂。RNA-seq通过一次检测剪接异常、转录本定量和AE克服这些局限，还能揭示RT-PCR或预测工具无法检测的意外isoform，如BCS1L 5′UTR变异。RNA-seq尤其适合携带多个可疑剪接变异病例，避免逐基因序贯检测并提高诊断效率。但RNA-seq也有局限：RT-PCR可检测的致病事件可能因低读长深度、低基因表达、NMD或3′偏倚而漏检；研究支持将最小表达阈值5 TPM作为RNA-seq数据解释前提，并建议用独立技术如cDNA Sanger测序或minigene assay进行正交验证。非靶向方法性能依赖多个分析前、分析和生物信息因素，需实验室特异优化。研究人员标准化使用皮肤成纤维细胞，其线粒体基因覆盖广，但MD固有异质性可影响表达谱，包括年龄和培养条件，因为成纤维细胞培养液在生化呼吸链分析时补充尿苷和丙酮酸。成纤维细胞适合MD诊断，表达约90% MD基因和65% OMIM基因，但部分基因（AARS2、NARS2、UFM1）在本队列中表达明显低于GTEx数据。使用内部对照队列进行RNA-seq标准化可提高AE检测可靠性。测序深度方面，超过100 million reads被认为最适于稳健检测剪接异常，但本研究显示约35 million reads在结合临床关联时足以检测AE。研究人员使用两种互补统计方法：限制基因集上的BH校正和基于Z-score的过滤；BH校正控制假发现但漏掉约60%真阳性，Z-score方法提高敏感性，识别出额外候选且假阳性数量可控（每例患者约100个基因）。该联合策略尤其与HPO表型结合时，可在诊断中高效解释。变异解释和表征方面，ACMG/AMP指南将RNA-seq功能证据视为强证据；近期框架推荐使用PVS1(RNA)准则，需考虑基因特异背景、残余转录本水平和功能影响。研究中变异分类纳入PVS1(RNA)，强度随RNA表型变化。基因特异专长也必要，尤其是逃逸NMD的框内剪接变异或激活隐秘剪接位点的内含子变异；例如AARS2、MSTO1和WARS2变异产生对照中也可检测但水平较低的替代转录本。本研究报道5个新内含子变异和1个新大缺失，RNA分析确认其致病性；这使4个错义VUS应用PM3准则后重分类为LP。1例患者2因低基因表达限制解释；另1例患者4未检测到显著AS，但MAE和共分离数据支持致病分类。局限与展望方面，非靶向分析主要聚焦AE，未来应整合剪接异常，并需真正非靶向方法在不依赖预定义基因列表下识别新致病基因；同时实现更高分析敏感性和足够特异性尤其困难。并非所有功能丧失变异导致可测转录本丰度变化，例如患者8携带两个BCS1L功能丧失变异但无明确BCS1L表达降低；杂合功能丧失变异也可能不产生足够大的表达差异以达到统计显著。RNA-seq更广泛采用、测序成本下降和稳健分析工具可及将支持更大队列和更深测序；未来长读长RNA-seq将提供更高分辨率和洞见，PacBio和Oxford Nanopore等平台通过全长转录本测序改善复杂剪接和单倍型解析isoform检测。整合到常规诊断方面，本研究强调RNA-seq在常规诊断中靶向和非靶向分析的价值。研究人员将RNA-seq纳入诊断工作流，使其与基因组测序并列成为变异解释核心；鉴于成纤维细胞广泛基因覆盖，建议在未建立分子诊断时进行皮肤活检，并在培养条件中补充尿苷和丙酮酸。尽管RT-PCR后Sanger测序仍快速可及，但有明确局限；在足够深度下全面RNA-seq仍是功能变异评估金标准，前提是候选基因表达足够（> 5 TPM）。IGV等可视化工具可快速检测MAE和AS。由于NMD可能掩盖某些剪接事件，但也可检测MAE这一致病性强指标，建议初始RNA分析避免PT。随着WGS尤其通过国家平台更可及，WGS与RNA-seq联合增强变异优先级。非靶向RNA-seq可行，但优先考虑基因组变异可简化分析。最后，RNA-seq发现应谨慎解释并在必要时用RT-PCR确认。当组织取样不可行或基因不表达时，minigene assay和基因特异检测等替代功能方法可帮助明确未解决变异致病性，例如未解决两例涉及线粒体氨酰tRNA合成酶基因（AARS2和NARS2，患者4和9）可能需体外翻译研究。新兴技术包括CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）编辑细胞、患者来源诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）模型和类器官系统，也有望用于变异解释和疾病建模，但仍主要限于研究环境。
研究结论翻译：总之，在基因组测序时代，鉴定出数千个VUS的情况下，将稳健的变异过滤和解释策略整合到诊断工作流中已变得至关重要。RNA-seq为变异优先级排序和功能评估提供了有效方法。应将其纳入综合诊断框架，该框架结合基因组、生化、基因特异性功能检测和多组学方法，从而帮助克服罕见遗传病患者经历的诊断历程。
