全基因组常见结构变异分析鉴定FAM193B启动子中一个与阿尔茨海默病风险相关的调控性CCG重复

《Nature Neuroscience》：Genome-wide analysis of common structural variants in Alzheimer’s disease identifies a risk-associated regulatory CCG repeat in FAM193B

　　

尽管阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）具有多基因架构，并已鉴定出众多相关单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs），但结构变异（structural variants, SVs）的贡献尚不清楚。在本研究中，研究人员利用中国人群的长读长（long-read）测序数据（n = 11）和短读长（short-read）测序数据（n = 3,190），表明常见SVs对AD遗传力（heritability）的贡献超出常见SNPs。研究人员鉴定出FAM193B启动子中一个扩增的CCG重复，其与AD风险增加呈全基因组显著关联（每增加10个重复的比值比（odds ratio, OR）= 2.20，P = 5.5 × 10^?13）。扩增的FAM193B-CCG重复增加FAM193B表达，并介导脑FAM193B表达与AD风险之间的多效性关联（pleiotropic association）。对死后人脑（postmortem human brains）和培养的神经元细胞（cultured neuronal cells）的分析表明，神经元FAM193B表达升高与DNA损伤（DNA damage）和细胞死亡相关通路（cell death-related pathways）相关。这些发现确立常见FAM193B-CCG重复为AD风险遗传因子，并强调常见SVs对AD遗传力的贡献。

该研究发表于《Nature Neuroscience》。阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，也是最常见的痴呆类型之一，具有高度遗传性和多基因架构。全基因组关联研究（genome-wide association studies, GWASs）已鉴定出70多个AD风险位点，其中多数为次等位基因频率（minor allele frequency, MAF）>0.05的常见变异，例如APOE ε4，其具有较高疾病外显率（杂合携带者OR=3.2）。然而，已知AD相关遗传变异不能完全解释观察到的AD遗传力，提示存在未鉴定的疾病相关遗传因素。既往遗传研究主要关注SNPs等小变异，而结构变异（structural variants, SVs；影响大于50个碱基对的基因组区域）的疾病关联被 largely 忽视。与SNPs相比，SVs影响更多核苷酸内容，并参与疾病易感性；罕见SVs对AD和其他神经退行性疾病具有较强风险效应，但常见SVs如何贡献AD风险尚不清楚。由于常见SVs高 prevalence，研究其在调节AD风险和基因表达中的作用对理解一般人群AD遗传病因重要。此外，微阵列或短读长测序（short-read sequencing, SRS）技术无法准确发现或基因分型超过一半的SVs，而长读长测序（long-read sequencing, LRS）可敏感发现SVs并提供序列和断点信息。因此，研究人员采用小规模LRS数据与大规模SRS数据结合的混合测序策略，研究常见SVs对AD的贡献。

关键技术方法（≤250字）：研究人员使用PacBio连续长读长数据来自11个中国基因组，包括2个内部测序样本和9个公共样本，其中6个为亲子三联体、其余为无关个体。短读长高覆盖数据来自香港中文队列（n=2,333），并包括中国大陆独立队列和UK Biobank等验证样本。分析结合NGMLR和minimap2比对，使用Sniffles2、cuteSV和SVIM进行SV调用，Jasmine合并，随机森林过滤；用Paragraph在SRS中基因分型；用HipSTR、GangSTR、ExpansionHunter和EnsembleTR对FAM193B-CCG重复基因分型；还进行多基因风险评分（polygenic risk score, PRS）、表达数量性状位点（expression quantitative trait loci, eQTL）、基于汇总数据的孟德尔随机化（summary data-based Mendelian randomization, SMR）、单核RNA测序（single-nucleus RNA-seq, snRNA-seq）、脑磁共振成像、电泳迁移率变动分析及FAM193B过表达和RNA-seq。

研究结果：

1. SV识别和基因分型：研究人员基于11个中国基因组的PacBio连续长读长数据，结合两种比对工具和三种SV调用器，经随机森林模型过滤获得44,122个高置信SVs（21,821个插入和22,301个缺失）。在包含2,333名香港华人队列中用Paragraph进行SRS基因分型，经严格过滤保留17,294个高置信SVs，其中6,792个为MAF>0.05的常见SVs。过滤后Mendelian错误率下降，SRS与LRS等位基因频率相关性增强，F1分数高。结论：混合测序策略可识别和基因分型高置信SVs。

2. SVs功能注释：通过功能基因组元件富集分析发现，插入和缺失在外显子、3′非翻译区（3′ untranslated regions, 3′ UTRs）、远端增强子样签名和CTCF结合区较少；缺失在蛋白编码基因中较少，在假基因中较多。神经疾病风险位点比其他疾病位点含有更多SVs；高CADD-SV有害性评分的SVs更可能位于已知疾病风险位点，但61.3%的高害SVs不在任何已知风险位点。结论：SVs相对不耐受于功能区域，可能调节基因表达和功能，并可能标记既往GWAS未研究的疾病风险位点。

3. 常见SVs对AD的多基因效应：通过GWAS和PRS分析（排除APOE位点），SV模型预测AD风险优于SNP模型（r²=0.056，AUROC=0.611 vs r²=0.046，AUROC=0.597，P=0.022），SNP和SV的PRS弱相关（r²=0.005）。SNP+SV模型解释更多AD方差（r²=0.098，AUROC=0.649），优于单独模型。条件PRS分析排除SVs与SNPs连锁不平衡混杂。在验证中，轻度认知障碍（mild cognitive impairment, MCI）个体PRS介于认知正常对照（NCs）和AD患者之间；高PRS组AD和MCI比例更高；SV模型和SNP+SV模型区分MCI与NC优于SNP模型。结论：常见SVs贡献常见SNPs未捕获的额外AD遗传力。

4. FAM193B位点常见AD风险重复多态性的识别：分析预测高害的常见SVs，发现FAM193B启动子/5′UTR插入最显著与AD相关；PacBio HiFi测序验证该插入为扩增的CCG重复。串联重复调用器显示FAM193B-CCG重复高度多态，等位基因从4到超过30个重复。在香港华人队列中，该重复在加性模型（β=0.056，P=5.3×10^?8）和显性模型（β=0.081，P=8.1×10^?10）均与AD风险增加显著相关，并在中国大陆独立队列复制。两个中国队列meta分析显示全基因组显著关联（加性模型β=0.048，P=1.2×10^?9；显性模型β=0.079，P=5.5×10^?13；n=1,516 AD vs n=1,674 NC），每10个重复的OR=2.20。≥18个CCG重复与AD关联最显著（OR=2.11，95% CI：1.68?2.65，P=1.1×10^?10），在NC和AD患者中携带频率分别为0.199和0.309。UK Biobank欧洲人群中该重复呈名义显著关联，≥19个CCG重复最显著（OR=1.21，95% CI：1.05?1.41，P=1.1×10^?2）。条件分析表明其效应独立于附近SNPs；局部祖源分析提示东亚局部祖源与其正交互，可能解释中国人群更强风险效应。结论：常见FAM193B-CCG重复是AD风险变异，在中国和欧洲人群均存在，中国人群外显率更高。

5. FAM193B-CCG重复介导FAM193B表达与AD的多效性关联：FAM193B在人体组织中广泛表达且细胞类型特异性低。血液eQTL分析显示该重复增加FAM193B表达（β=0.026，P=9.1×10^?29），AD患者血液FAM193B表达高于NCs。脑eQTL和snRNA-seq显示该重复与脑及神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等FAM193B表达增加相关，AD患者这些细胞中FAM193B表达较高。SMR和HEIDI检验表明该重复是AD和血液/脑FAM193B表达的共享因果变异；SMR-multi显示仅脑FAM193B关联保持显著，细胞类型SMR提示神经元FAM193B通过所有SMR测试。表观分析显示该区域具有启动子样特征，MAZ为候选转录因子；MAZ敲低降低FAM193B表达；电泳迁移率变动分析显示MAZ结合25个CCG重复强于11个重复；HEK293T中25个CCG重复启动子驱动更高FAM193B表达。结论：FAM193B-CCG重复是因果变异，调节FAM193B表达，并介导神经元FAM193B表达与AD风险的多效性关联。

6. FAM193B-CCG重复对神经退行相关通路的影响：snRNA-seq显示该重复在神经元中引起最大转录组变化，且其与神经元基因表达的关联和AD与神经元基因表达的关联相关（r=0.615，P<2.2×10^?308）。GO分析显示正相关基因富集于细胞死亡相关通路，如巨自噬、神经元死亡和神经元凋亡过程。脑磁共振成像显示更长FAM193B-CCG重复与灰质体积减少相关（β=?0.015，P=8.3×10^?3）。在神经母细胞瘤IMR-32细胞中，FAM193B过表达增加γH₂AX焦点形成（P=0.006），RNA-seq鉴定270个差异表达基因，上调基因富集于氧化磷酸化和Ras蛋白信号转导，下调基因富集于应激反应；GSEA显示G1/S DNA损伤检查点和凋亡调节上调。结论：FAM193B表达升高导致DNA损伤和细胞死亡相关通路激活，促进神经元死亡。

讨论部分总结：该研究强调常见SVs对AD的贡献，并识别FAM193B-CCG重复为AD风险遗传因子。尽管已发现众多AD风险SNPs，其估计遗传力低于双生子研究，SVs可能解释缺失遗传力。PRS分析表明常见SVs贡献额外疾病风险；约18%常见SVs不被SNPs标记，尤其位于串联重复内。包括SVs可更全面估计全局遗传风险并改善风险预测。常见SVs对人类表型效应量可大于常见SNPs；5.9%中国个体携带至少21个FAM193B-CCG重复，AD风险OR=2.89（95% CI：1.98?4.22）。串联重复扩增是特定神经疾病因果因素；该研究发现的常见串联重复多态也贡献AD风险。调节区串联重复可通过调节转录因子结合调节基因表达。FAM193B功能仍不清楚，但近期LRS研究将罕见FAM193B-CCG扩增与罕见病联系。欧洲AD GWAS报道rs335480为FAM193B位点全基因组显著风险SNP；连锁不平衡、条件和SMR分析提示FAM193B-CCG重复是rs335480标记的因果变异。神经元FAM193B在AD发病中重要；FAM193B蛋白与GSK3α和GSK3β相互作用，这些激酶失调导致β-amyloid产生增加和tau过度磷酸化。需要功能研究探讨FAM193B在神经退行和AD发病机制中的作用。

研究结论翻译：总之，通过研究常见SVs，研究人员将FAM193B鉴定为AD易感性位点，揭示一个常见CCG重复多态性作为潜在因果变异。将SVs纳入大规模GWAS将有助于解析缺失遗传力、推进机制认识并提供新的候选治疗靶点。