《Foods》：Engineering a Hyper-Adherent E. coli Nissle Probiotic Strain That Reduces Intestinal Carriage of Salmonella Pathogens in Poultry
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## 论文摘要专业翻译
禽肉和禽蛋是沙门氏菌食源性疾病的主要来源，其原因在于鸡的肠道微生物组中携带这些细菌性病原体，这至今仍是全球范围内持续存在的食品安全问题。减少或消除家禽中沙门氏菌的携带将显著改善食品安全状况，并减少人类沙门氏菌病的发生案例。本研究代表了一
## 论文摘要专业翻译
禽肉和禽蛋是沙门氏菌食源性疾病的主要来源，其原因在于鸡的肠道微生物组中携带这些细菌性病原体，这至今仍是全球范围内持续存在的食品安全问题。减少或消除家禽中沙门氏菌的携带将显著改善食品安全状况，并减少人类沙门氏菌病的发生案例。本研究代表了一种减少或消除家禽群中沙门氏菌携带的新策略。研究人员构建了一株表达具有高黏附水平沙门氏菌因子的大肠杆菌Nissle 1917益生菌菌株。大肠杆菌Nissle 1917作为益生菌支架已被用于治疗人类肠道疾病多年，并被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为一般公认安全（GRAS）。该益生菌菌株对宿主细胞表现出高水平的黏附能力，事实上，其黏附水平高于携带相同Ⅰ型菌毛基因的沙门氏菌菌株。研究人员证明，该益生菌菌株在组织培养细胞的黏附竞争中显著胜过致病性沙门氏菌菌株（超过100倍；>2个对数单位），并且体内实验挑战表明，该益生菌菌株介导了沙门氏菌从肉鸡、蛋鸡和火鸡肠道中的显著排斥效应（超过10倍减少；>1个对数单位）。
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**一、研究背景与问题提出**
沙门氏菌是全球范围内最重要的食源性致病菌之一。据美国疾病控制与预防中心（CDC）估计，美国每年因沙门氏菌感染导致约135万人患病和26,500人住院治疗，造成每年约41亿美元的生产力损失。世界卫生组织（WHO）评估显示，全球每年沙门氏菌肠胃炎病例接近9000万例，相关死亡约15万例。其中约30%的人类沙门氏菌胃肠炎病例与禽肉消费有关，因此减少家禽携带的致病性沙门氏菌菌落形成单位（CFU）成为紧迫的食品安全优先事项。
沙门氏菌在禽类肠道微生物组中的定植是其造成食品安全风险的关键起始环节。大量研究已鉴定和表征了沙门氏菌的多种毒力因子，包括细胞侵袭相关基因（SPI-1及效应因子）、宿主细胞内生存相关基因（SPI-2及效应因子）、脂多糖（LPS）以及血清耐药性相关基因等。尽管这些研究极大地丰富了人们对致病性沙门氏菌生物学和毒力策略的认识，但对人类沙门氏菌病发病率的影响却微乎其微。
研究表明，Ⅰ型菌毛（T1F）在沙门氏菌定植禽类肠道微生物组中发挥着关键作用，其通过介导细菌与禽类肠道上皮细胞的黏附来实现在肠道中的持续存在。沙门氏菌通过Ⅰ型菌毛黏附竞争营养物质和空间，从而在肠道微生物组中建立生态位。虽然在许多沙门氏菌血清型中编码有其他菌毛基因簇（如Bcf、Csg、Pef、Lpf和Tafi），但功能研究表明这些因子在肠道黏附中未显示显著作用，而Ⅰ型菌毛对于沙门氏菌在家禽肠道微生物组中的建立至关重要。
一项前瞻性研究提供了重要的流行病学线索：英格兰、威尔士和德国的家禽沙门氏菌监测计划通过“检测-屠宰”策略控制了鸡伤寒沙门氏菌（S. Gallinarum），但与此同时，人病原体肠炎沙门氏菌（S. Enteritidis）成为定植家禽肠道的优势血清型，人类沙门氏菌病病例也相应急剧增加。这种反向关系表明，肠炎沙门氏菌填补了鸡伤寒沙门氏菌被根除后空出的生态位。该研究的结论是，减少家禽中人致病菌株携带的有效途径是工程化一株保留了排斥肠炎沙门氏菌能力但丧失毒力的口服活减毒鸡伤寒沙门氏菌菌株。然而，无论遗传特征如何，沙门氏菌菌株被批准为农业用益生菌的可能性似乎很低。因此，研究人员采用了不同的策略：以已被FDA认定为GRAS的大肠杆菌Nissle 1917为支架，工程化一株表达高黏附性沙门氏菌Ⅰ型菌毛的益生菌菌株，通过占据肠道黏附生态位来竞争性排斥致病性沙门氏菌。
**二、主要技术方法概述**
研究人员采用了多种关键技术方法。菌株构建方面，利用一步失活诱变技术（使用质粒pKD3、pKD4、pKD46和pCP20）在大肠杆菌Nissle 1917中依次敲除fimA基因（删除内源大肠杆菌Ⅰ型菌毛的黏附素基因fimH）和asd基因（天冬氨酸半醛脱氢酶基因），构建了非黏附且依赖二氨基庚二酸（DAP）生长的支架菌株。随后将携带功能性大肠杆菌asd基因的pACYC衍生质粒pBDJ451（含鼠伤寒沙门氏菌LT2衍生Ⅰ型菌毛基因簇）转化入大肠杆菌Nissle Δasd菌株，利用asd基因作为体内选择系统维持质粒稳定性，最终获得不含抗生素抗性基因的工程益生菌菌株。在动物实验中，研究对象包括来自美国爱荷华州Welp孵化场的一日龄肉鸡和蛋鸡，以及火鸡。细菌黏附表型通过酵母凝集试验和HeLa组织培养细胞黏附试验进行定量评估。体内竞争排斥实验在艾奥瓦州立大学进行，并获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。
**三、研究结果**
**3.1 非致病性高黏附沙门氏菌菌株的构建**
研究人员首先构建了一株非侵袭（SPI-1突变）、胞内生存缺陷（SPI-2突变）但携带高黏附性Ⅰ型菌毛等位基因的鼠伤寒沙门氏菌菌株BJ3716，该菌株缺失hilD和hilA上游调控序列（URS）以及ssaV基因。标准组织培养黏附试验结果显示，非黏附阴性对照菌株BJ3714（fimA突变体）的非特异性黏附为1.1×10? CFU/孔（约占原始接种物的1.1%）；致病性鼠伤寒沙门氏菌SL1344和多重耐药DT104的黏附分别为1.3×10? CFU/孔和9.2×10? CFU/孔，较阴性对照高13倍和9.2倍；而高黏附菌株BJ3716的黏附达1.2×10? CFU/孔，是阴性对照的120倍，比两种致病菌株高9.2倍和13倍。该实验证实，hilD、URS调控序列和ssaV的破坏对Ⅰ型菌毛高黏附表型无显著影响，为后续以大肠杆菌为支架构建高黏附益生菌提供了可行性基础。
**3.2 大肠杆菌Nissle 1917高黏附益生菌菌株的构建**
研究人员以大肠杆菌Nissle 1917为支架菌株，通过删除内源fimH基因（消除大肠杆菌Ⅰ型菌毛介导的黏附）和染色体asd基因，再导入携带沙门氏菌Ⅰ型菌毛基因簇和功能性asd基因的质粒pBDJ451，最终获得工程益生菌株大肠杆菌Nissle 1917 Δasd pBDJ451。该菌株不含抗生素抗性基因，依赖asd互补系统维持质粒。质粒稳定性试验表明，在无抗生素选择压力下培养50代后，质粒保有率约为94%±13%，显示pBDJ451在宿主菌株中高度稳定。
**3.3 大肠杆菌Nissle 1917 pBDJ451的黏附表型**
酵母凝集试验证实，大肠杆菌Nissle 1917亲本株和工程益生菌株均显示甘露糖敏感型凝集表型。沙门氏菌抗Ⅰ型菌毛兔多克隆抗体能有效抑制工程益生菌株和沙门氏菌BJ3716的凝集反应，但不能抑制大肠杆菌亲本株的凝集，证实工程益生菌株表面表达的是沙门氏菌Ⅰ型菌毛。定量黏附试验显示，鼠伤寒沙门氏菌BJ3716的黏附为1.0×10? CFU/孔，而大肠杆菌Nissle 1917 Δasd pBDJ451的黏附高达5.2×10? CFU/孔，为前者的5.2倍，这可能归因于多拷贝质粒pBDJ451上沙门氏菌Ⅰ型菌毛基因的高水平表达。
**3.4 竞争性黏附试验作为竞争性排斥的模型**
在竞争性黏附试验中，两种菌株同时加入同一组织培养孔中。结果显示，当大肠杆菌Nissle pBDJ451与鼠伤寒沙门氏菌SL1344竞争时，其黏附量高出143倍；与DT104竞争时高出185倍。这些结果表明，该工程益生菌株具有以极高水平黏附鸡肠道上皮细胞并排斥致病性沙门氏菌黏附的潜力，为体内的竞争性排斥效果提供了体外机制基础。
**3.5 大肠杆菌Nissle 1917 pBDJ451在家禽中竞争性排斥沙门氏菌**
在肉鸡和火鸡竞争性排斥实验中，研究人员将一日龄雏鸡和火鸡雏分别口服接种大肠杆菌Nissle 1917 pBDJ451（益生菌组）或亲本大肠杆菌Nissle 1917（对照组），随后接种野生型鼠伤寒沙门氏菌。肉鸡实验中，对照组鸡沙门氏菌计数约4000-5000 CFU，而益生菌处理组约300-400 CFU，减少了约12-16倍（>1个对数单位，90%减少）。火鸡实验中，益生菌处理组沙门氏菌计数从约200 CFU降至约30 CFU，与对照组相比通常有10-20倍差异（>1对数单位减少），且益生菌组火鸡沙门氏菌检测阳性的概率降低50%以上。将不同实验数据汇总后显示，益生菌处理组在肉鸡、火鸡和蛋鸡中的沙门氏菌脱落和盲肠定植均减少了10-100倍（90-99%减少），蛋鸡口服接种该益生菌后，鸡蛋蛋壳污染和输卵管逆行定植也显著减少。这一效果在鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌两种血清型中均得到证实。
**四、讨论与结论总结**
在讨论部分，研究人员指出，沙门氏菌的食品安全风险始于家禽肠道，Ⅰ型菌毛介导的黏附是其在肠道微生物组中定植的关键因素。尽管已有多种干预策略（如益生元、益生菌、细菌亚产品、噬菌体疗法和疫苗），但每种方法均存在局限性。现有两项益生菌研究显示了较好的效果，包括枯草芽孢杆菌DSM17299和唾液乳杆菌与屎肠球菌PXN33的联合应用，但均与本研究采用的靶向黏附竞争策略不同。
研究人员倾向于认为，该益生菌菌株发挥竞争性排斥作用的主要机制是通过竞争性结合致病性沙门氏菌的肠道上皮受体位点。但研究也提出了其他可能机制，包括改变微生物群组成以排斥沙门氏菌，或该菌株具有更强的营养竞争能力。由于所有比较均以接受亲本大肠杆菌Nissle菌株的鸟类为对照，这些替代解释均需该工程菌株相对亲本菌株具有显著不同的微生物群调节或营养竞争能力。研究人员也承认，目前仅验证了该益生菌对一株鼠伤寒沙门氏菌和一株肠炎沙门氏菌的排斥效果，其对其他致病性沙门氏菌菌株和血清型的效果需进一步研究。此外，研究人员指出了当前研究的局限性，包括尚未验证菌株在肠道中的长期存留时间、需要优化商业禽群中的给药剂量以及验证在野外条件下的有效性。
研究结论部分翻译如下：总体而言，研究结果表明，这种工程益生菌可能作为一种非致病性竞争菌株，通过靶向生态位占据和基于黏附的排斥机制，置换或阻止毒力沙门氏菌血清型的定植。随着减少食用动物生产中抗生素使用与满足日益严格的食品安全标准的双重压力不断增加，该策略代表了控制家禽肠道病原体的一项创新技术。除了减少禽群中的沙门氏菌携带外，这项工作为合理工程化靶向益生菌奠定了基础，使益生菌能够针对特定微生物环境中的病原体赢得定植竞争，从而改善动物健康、增强食品安全并减少食源性疾病向人类传播的负担。
