妊娠中期补充褪黑素缓解仔猪宫内生长受限（IUGR）并伴随胎盘DNA甲基化改变

《International Journal of Molecular Sciences》：Melatonin Supplementation During Middle Gestation Alleviates Intrauterine Growth Restriction in Piglets and Is Associated with Alterations in Placental DNA Methylation

宫内生长受限（intrauterine growth restriction, IUGR）对家畜繁殖性能具有负面影响。在本研究中，研究人员试图探究母猪IUGR的病因，并检验褪黑素（melatonin）对IUGR的潜在有益作用及其潜在分子机制。结果表明，妊娠母猪外周血中褪黑素浓度与IUGR比例呈负相关，且IUGR仔猪脐带血中褪黑素浓度异常降低。给母猪补充适当剂量的褪黑素可提高仔猪平均出生体重并降低IUGR仔猪比例。简化代表性亚硫酸氢盐测序（reduced representation bisulfite sequencing, RRBS）揭示，母猪胎盘中异常DNA甲基化（DNA methylation）与IUGR仔猪直接相关。负责胎盘功能的关键基因DNA甲基化增加下调其表达。基因下调导致胎盘功能障碍和IUGR。褪黑素显著降低与胎盘功能相关基因的DNA甲基化。研究人员鉴定出，妊娠中期补充褪黑素特异性靶向胎盘基因的CGI（CpG island, CGI）、CGI shore、外显子、内含子和3^′非翻译区（3^′ untranslated region, 3^′ UTR）。这些结果为应对猪及其他物种中IUGR高发提供了新信息。

宫内生长受限（intrauterine growth restriction, IUGR；胎儿宫内生长速度低于正常水平，出生体重至少低于同胎龄正常胎儿10%）对家畜繁殖性能产生负面影响。猪作为多胎家畜，每窝可达25%仔猪发生IUGR，IUGR仔猪常表现为存活率降低、生长性能受损和肉品质差。胎盘是母胎循环间营养物质和废物交换的界面，胎盘功能障碍可导致IUGR。DNA甲基化（DNA methylation；一种表观遗传修饰，通常与基因表达抑制相关）参与胎盘形成和功能调控，IUGR胎盘DNA甲基化改变已被广泛研究。妊娠期活性氧（reactive oxygen species, ROS；细胞代谢产生的高反应性含氧分子）产生增加和抗氧化能力下降可通过氧化应激促进IUGR。褪黑素（melatonin）具有抗氧化和抗炎特性，妊娠女性血清褪黑素高于非妊娠者，IUGR时外周血褪黑素降低且褪黑素受体1A（melatonin receptor 1A, MTNR1A）和1B（MTNR1B）表达下调。母猪妊娠90至114天补充褪黑素可增加仔猪出生体重和断奶存活率。褪黑素还可重编程DNA甲基化。然而，妊娠中期补充褪黑素是否通过调节胎盘DNA甲基化改善胎盘功能尚不清楚。因此，研究人员假设妊娠期补充褪黑素与胎盘DNA甲基化改变和胎儿生长相关，并在母猪妊娠中期补充褪黑素，采用简化代表性亚硫酸氢盐测序（reduced representation bisulfite sequencing, RRBS）表征胎盘DNA甲基化谱，整合甲基化与转录组数据鉴定候选基因。该研究结论为：研究人员鉴定出与仔猪IUGR相关的独特胎盘DNA甲基化模式，观察到循环或脐带血褪黑素浓度与IUGR发生率呈负相关；妊娠中期补充褪黑素与仔猪出生体重增加、IUGR发生率降低以及胎盘DNA甲基化和基因表达改变相关；整合RRBS和转录组分析鉴定出COL21A1、PPARA、CACNA1S、ITPR3和PRKCA等候选基因，这些基因表现出DNA甲基化和mRNA表达的协同变化。该研究揭示了褪黑素补充、胎盘表观遗传特征与胎儿生长之间的关联，并为进一步研究提供了候选分子靶点。但靶向甲基化验证和功能研究仍需开展，以确定这些表观遗传改变是否直接促成褪黑素补充相关的有益作用。

关键技术方法：样本来自北京丰森源农业发展有限公司（Beijing Fengsenyuan Agricultural Development Co., Ltd., Beijing, China）的法国杂交母猪，初产、约1岁、体重约200 kg，妊娠60天共30头分为对照组、低剂量褪黑素组（LMT，2 mg/kg）和高剂量褪黑素组（HMT，5 mg/kg），每组初始10头，处理期为妊娠60至90天。第90天每组随机选3头屠宰收集胎盘，剩余每组6头分析繁殖性能；出生体重<1.1 kg定义为IUGR，≥1.1 kg定义为正常出生体重（normal-birth-weight, NBW）。方法包括高效液相色谱-质谱（high-performance liquid chromatography–mass spectrometry, HPLC-MS）检测血清褪黑素、胎盘转录组测序、RRBS、实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）；DMR用DSS鉴定，甲基化差异≥20%且FDR<0.05；并进行GO和KEGG富集及DMR与DEG整合分析。

研究结果：
2.1 褪黑素补充对IUGR发生率及母猪繁殖性能的影响：通过检测妊娠母猪外周血褪黑素与每窝IUGR比例，研究人员发现二者呈显著负相关；IUGR仔猪脐带血褪黑素浓度显著低于正常出生体重仔猪。补充2和5 mg/kg褪黑素均显著升高母猪外周血褪黑素，且不影响窝产仔数。2 mg/kg褪黑素显著提高仔猪平均出生体重并降低IUGR比例；5 mg/kg仅略提高平均出生体重或略降低IUGR比例，但未达显著差异。
2.2 褪黑素对胎盘全基因组DNA甲基化谱和模式的影响：为分析机制，研究人员对对照组正常仔猪（CN）、对照组IUGR仔猪（CI）、褪黑素处理正常仔猪（MN）和褪黑素处理IUGR仔猪（MI）胎盘进行RRBS。16个文库获得33,272,897至50,695,963条clean reads，定位率为76.64%至81.1%，亚硫酸氢盐转化率为99.535%至99.602%。C位点平均覆盖深度为17.1375。CG甲基化最普遍，CHG和CHH较少，后续聚焦CpG甲基化。样本间CpG相关性较高（R²>0.783），基因功能区域甲基化水平分布一致。
2.3 褪黑素处理对基因功能区域甲基化水平分布的影响：通过比较不同功能区域CpG甲基化分布，发现猪胎盘CpG甲基化主要集中于CGI shore、内含子和3^′非翻译区（3^′ untranslated region, 3^′ UTR）。从上游至基因体及下游，mCG甲基化水平先降低后升高再趋于平稳。与CN相比，CI在CGI、CGI shore、外显子、内含子和3^′ UTR中CpG甲基化水平较高；MI在褪黑素补充后与CI不同。MI与MN及MN与CN的差异甲基化主要分布于CGI shore、内含子和重复区域。CI与CN及MI与CI的差异甲基化主要集中在基因体和下游区域；MI与MN及MN与CN的差异甲基化主要集中于基因体。
2.4 褪黑素对猪胎盘DNA甲基化改变动态的影响：通过鉴定差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMRs；不同组间甲基化水平显著不同的基因组区域），发现DMR长度主要约100 bp。CI与CN间鉴定出1719个DMR，其中1222个高甲基化、497个低甲基化，注释到858个基因；MI与CI间鉴定出1787个DMR，其中836个高甲基化、951个低甲基化，注释到903个基因；MI与MN间鉴定出2100个DMR，其中1191个高甲基化、909个低甲基化，注释到1061个基因。CI与CN及MI与CI的DMR主要位于染色体NC_010448.4；MI与MN的DMR主要位于NC_010461.5。DMR主要锚定于内含子、CGI和CGI shore，较少分布于TSS和TES。
2.5 DMR相关基因GO和KEGG通路富集分析：通过Gene Ontology（GO；基因功能注释分类体系）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG；通路富集分析数据库）分析，CI与CN的DMR显著富集于炎症反应介体产生、整合素结合、蛋白激酶B活性激活、细胞黏附分子结合和一氧化氮介导信号转导等条目；MI与CI的DMR富集于染色体浓缩、细胞黏附蛋白复合物、碳水化合物转运、端粒维持正调控和乳酸代谢等；MI与MN的DMR富集于多巴胺生物合成、翻译调节活性、胚胎器官发育、儿茶酚胺生物合成和转运体活性等。KEGG显示，CI与CN富集于Wnt信号、Rap1信号、蛋白质消化和吸收；MI与CI富集于血管平滑肌收缩、甲状腺激素合成和Rap1信号；MI与MN富集于肌动蛋白细胞骨架调节、蛋白质消化和吸收及PI3K-Akt信号。
2.6 DMR与DEG整合分析：通过整合胎盘甲基化和转录组测序结果，CI与CN间有35个重叠基因，富集于蛋白质消化和吸收（COL21A1、LOC110259172）、PPAR信号（PPARA）和黏蛋白型O-聚糖生物合成（ST3GAL1）。MI与CI间有107个重叠基因，富集于蛋白质消化和吸收（COL5A1、COL21A1）和血管平滑肌收缩（CACNA1S、ITPR3、PRKCA）。MI与MN间有16个重叠基因，富集于VEGF信号（PRKCB）和赖氨酸降解（TNFRSF13C、PRKCB、LOC102165485）。qRT-PCR表明，与CN相比，CI胎盘中COL21A1、CACNA1S、PPARA和ST3GAL1 mRNA水平显著降低，褪黑素补充后可部分恢复；MI中COL5A1、ITPR3和PRKCA表达显著升高。

讨论部分总结：研究人员指出，胎盘作为母胎间营养物质、氧气/二氧化碳和代谢废物转运的“转运站”，其健康是胎儿正常生长发育的前提，胎盘异常可导致IUGR。当前有效预防或降低IUGR的干预有限，因此理解其机制必要。褪黑素具有调节昼夜节律、抗氧化和抗炎等多种生物学功能，胎盘存在局部褪黑素能系统，包括合成酶AANAT（aralkylamine N-acetyltransferase）和ASMT（acetylserotonin O-methyltransferase）以及受体MTNR1A和MTNR1B。既往研究报道IUGR妊娠脐带血褪黑素浓度显著低于正常妊娠，胎盘褪黑素浓度与胎儿出生体重正相关，本研究也观察到母猪外周血褪黑素与IUGR发生率负相关，IUGR仔猪脐带血褪黑素显著降低。猪多胎且IUGR自然发生率高达25%，是研究IUGR的天然模型。Peng and colleagues (2021) 报道从妊娠早期到分娩补充褪黑素可降低出生体重低于900 g仔猪比例，并认为与该分子抗氧化特性有关；但ROS在早期妊娠胎盘血管发育中也有重要生理作用，过度抗氧化补充未必总有益，子痫前期相关模型提示早期补充褪黑素在某些条件下可能加重胎儿生长受限。研究人员此前研究表明，晚期妊娠补充2 mg/kg褪黑素可改善胎盘抗氧化能力、促进胎儿生长并增加仔猪出生和断奶体重，但中期补充是否有影响尚无报道。本研究中，妊娠60至90天补充2 mg/kg褪黑素显著提高平均出生体重并降低IUGR率；将剂量增至5 mg/kg未进一步改善繁殖结局。两种剂量均显著升高母猪循环褪黑素浓度，但仅2 mg/kg显著改善平均出生体重和IUGR比例，提示中期褪黑素的有益作用不呈简单线性剂量反应关系，达到有效生理范围后过量补充未必提供额外益处；正常胎盘发育和血管生成需要氧化与还原信号平衡，增加抗氧化剂剂量未必成比例增强胎盘功能。由于仅检测两个剂量，2和5 mg/kg反应差异的精确机制仍不清楚，需进一步剂量反应研究确定最佳剂量和治疗窗。DNA甲基化是哺乳动物常见表观修饰，可抑制基因表达。猪胎盘DNA甲基化模式随妊娠阶段变化，IUGR仔猪胎盘DNA甲基化水平较高。褪黑素可影响表观调控，降低5-mC水平，下调DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1, DNMT1）和甲基CpG结合蛋白2（methyl-CpG-binding protein 2, MeCP2）表达。本研究中，中期补充褪黑素与胎盘多个基因组区域DNA甲基化改变相关，包括CGI、CGI shore、外显子、内含子和3^′ UTR，并伴随胎儿生长改善，但这些发现主要为关联性，不能确定DNA甲基化改变直接导致IUGR发生率降低。整合DMR和DEG后，正常与IUGR仔猪胎盘间35个差异表达基因富集于蛋白质消化和吸收、氮代谢、PPAR信号和黏蛋白型O-聚糖生物合成。COL21A1在IUGR胎盘高甲基化且mRNA低表达，褪黑素补充后甲基化降低且mRNA升高；COL21A1是细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的重要成分，参与ECM组装和稳定，细胞与ECM互作对胎盘发育重要。既往研究报道IUGR仔猪胎盘COL1A2表达显著低于正常仔猪。胎盘血供不足是导致胎盘功能障碍和IUGR的重要因素，可能与一氧化氮（nitric oxide, NO）代谢紊乱有关；NO是调节胎盘血管张力和子宫胎盘血流的信号分子，动物和人类研究均提示NO降低与IUGR相关。本研究中，褪黑素补充与CACNA1S、ITPR3和PRKCA等基因甲基化和表达改变相关，这些基因富集于血管平滑肌收缩通路；但未直接检测NO产生和胎盘血流，功能后果需进一步研究。PPARA（peroxisome proliferator-activated receptor alpha）参与脂质代谢、脂肪酸氧化、氧化应激以及与NO产生和血管生成相关的通路；本研究中IUGR胎盘PPARA DNA甲基化升高、mRNA表达降低，提示PPARA甲基化和表达改变可能与IUGR胎盘代谢调节受损相关，但其功能贡献需进一步研究。ST3GAL1（ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 1）富集于黏蛋白型O-聚糖生物合成，IUGR中甲基化异常升高导致表达降低；ST3GAL1催化唾液酸转移，参与胚胎发育、神经发育和免疫反应，破坏唾液酸化通路可致小鼠胚胎致死，提示其表达改变可能与胎盘功能和胎儿生长有关，但在猪胎盘发育和IUGR中的具体作用仍待阐明。研究人员还指出，本研究未检测胎盘褪黑素浓度及MTNR1A和MTNR1B表达，因此观察到的胎盘DNA甲基化和基因表达改变是胎盘局部褪黑素信号直接作用还是全身间接作用仍不清楚，需进一步研究区分。

研究结论翻译：在本研究中，研究人员鉴定出与仔猪IUGR相关的独特胎盘DNA甲基化模式，并观察到循环或脐带血褪黑素浓度与IUGR发生率呈负相关。妊娠中期补充褪黑素与仔猪出生体重增加、IUGR发生率降低以及胎盘DNA甲基化和基因表达改变相关。整合RRBS和转录组分析鉴定出若干候选基因，包括COL21A1、PPARA、CACNA1S、ITPR3和PRKCA，这些基因表现出DNA甲基化和mRNA表达的协同变化。这些发现揭示了褪黑素补充、胎盘表观遗传特征与胎儿生长之间的关联，并为进一步研究提供了候选分子靶点。然而，需要进行靶向甲基化验证和功能研究，以确定这些表观遗传改变是否直接促成与褪黑素补充相关的有益作用。这些结果为降低猪及其他物种中IUGR的高发提供了补充信息。