虫草多糖减轻实验性缺血性脑卒中损伤：与IL-17/NF-κB信号通路的相关性研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Cordyceps Polysaccharides Attenuate Experimental Ischemic Stroke Injury: Association with IL-17/NF-κB Signaling

　　

摘要专业翻译 虫草多糖（Cordyceps polysaccharides, CSP）在缺血性脑卒中中显示出保护潜力，但其中枢炎症机制仍不清楚。本研究探讨了CSP的作用是否与白细胞介素-17（IL-17）/核因子κB（NF-κB）相关信号通路有关。研究人员整合并分析了公开可用的人类转录组数据集，以识别缺血性脑卒中中与炎症相关的通路，并分析了一个公开的小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）单细胞RNA测序（RNA-seq）数据集，以识别相关的脑细胞群体。研究人员在氧-葡萄糖 deprivation（OGD）暴露的SH-SY5Y细胞中进行了IL-17受体A（IL-17RA）敲低实验。研究人员进一步在MCAO大鼠和OGD暴露的BV-2细胞中评估了CSP的作用。生物信息学分析显示，缺血性脑卒中数据集中IL-17和NF-κB信号通路显著富集，单细胞模块评分分析显示，小胶质细胞在MCAO相关的IL-17/NF-κB相关模块评分中表现出最大的增加。IL-17RA敲低提高了OGD暴露的SH-SY5Y细胞的活力。在MCAO大鼠中，CSP改善了神经和行为的结局，增加了脑血流量，并减少了脑水肿、梗死体积、神经元丢失、小胶质细胞反应以及IL-17A/IL-17RA的表达。在OGD暴露的BV-2细胞中，CSP降低了IL-17A、IL-17RA、NF-κB激活因子1（ACT1）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）、IL-1β、IL-6以及磷酸化p65/总p65的比值。这些发现表明，CSP在缺血性脑卒中模型中的保护作用与IL-17/NF-κB相关神经炎症的减轻有关。

论文解读文章

一、研究背景与目的

缺血性脑卒中（Ischemic stroke, IS）是全球最常见的卒中类型，也是导致死亡和残疾的主要因素。2021年全球新增约780万例缺血性脑卒中患者，近三十年来这一公共卫生负担持续增长。目前主要的治疗策略集中于通过再灌注疗法恢复脑血流，包括组织型纤溶酶原激活剂（tPA）静脉溶栓和血管内取栓术。然而，严格的治疗时间窗和高昂的治疗费用限制了相当比例患者及时获得有效治疗。因此，开发能够增强脑组织对缺血损伤抵抗力的新型神经保护策略和药物具有重要的临床和公共卫生意义。

缺血性脑卒中发生后，动脉狭窄或闭塞导致的脑血流减少引起氧和葡萄糖供应不足，造成能量代谢障碍和离子稳态破坏，最终引发钙超载和谷氨酸介导的兴奋性毒性，导致神经元坏死和凋亡。随后，缺血核心区及周围区域迅速发生复杂的神经炎症反应。活化的小胶质细胞和星形胶质细胞释放多种促炎介质，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6），促进外周免疫细胞浸润并加剧局部炎症反应。同时，血脑屏障（BBB）通透性增加和炎症介质渗漏进一步加重脑水肿和脑组织损伤。大量证据表明，炎症级联反应的过度激活是缺血半暗带继发性神经元死亡和梗死体积扩大的关键病理机制。

在缺血性脑损伤涉及的炎症通路中，白细胞介素-17（IL-17）作为缺血后神经炎症的重要调节因子日益受到关注。既往研究已证明，大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）后脑组织中IL-17水平升高，并伴随脑梗死体积增加。因此，调节IL-17介导的炎症信号通路可能成为减轻缺血性脑损伤的潜在治疗靶点。

虫草多糖（Cordyceps polysaccharides, CSP）是冬虫夏草的主要活性成分，已在多种实验疾病模型中显示出保护作用，主要通过调节炎症和氧化应激相关通路实现。例如，CSP已被证明可抑制TLR4/NF-κB信号通路并调节Nrf2/HO-1轴，从而在不同病理条件下减轻炎症反应。研究人员的既往研究表明，CSP在实验性缺血性脑卒中模型中具有预防性神经保护作用，并初步揭示了其作用机制，即通过保护肠道屏障完整性和降低IL-23表达来减少MCAO大鼠中IL-17的表达。然而，该研究主要关注外周肠-炎症轴在缺血性脑损伤中的作用，CSP对缺血性脑损伤的保护作用是否与中枢神经系统中IL-17/NF-κB信号通路的调节相关仍不清楚。

基于IL-17信号通路和NF-κB激活在缺血后神经炎症中的参与，本研究聚焦于IL-17/NF-κB相关炎症轴作为候选机制，旨在确定CSP是否在体内和体外减轻缺血性脑损伤，以及这种保护是否伴随IL-17/NF-κB相关炎症信号的变化。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员整合分析了三个公开的人类缺血性脑卒中转录组数据集（GSE16561、GSE22255和GSE58294），通过差异表达基因鉴定、GO和KEGG富集分析以及基因集富集分析（GSEA）识别与缺血性脑卒中相关的炎症通路。同时分析了公开的小鼠MCAO单细胞RNA测序数据集GSE174574，以识别相关的脑细胞群体。在细胞实验中，研究人员在氧-葡萄糖剥夺（OGD）暴露的SH-SY5Y细胞中进行IL-17RA敲低实验，并在OGD暴露的BV-2小胶质细胞中评估CSP的作用。在动物实验中，采用永久性大脑中动脉闭塞（pMCAO）大鼠模型，通过激光散斑血流成像、TTC染色、免疫组织化学、Western blot和ELISA等方法评估CSP的神经保护效果。

三、研究结果

3.1 CSP减轻MCAO大鼠的神经功能障碍

在pMCAO大鼠模型中，CSP组与MCAO组相比，脑含水量、脑指数和改良神经功能缺损评分（mNSS）显著降低，表明神经功能改善。旷场实验结果显示，CSP组大鼠的总运动距离和进入中央区域的次数显著增加，提示运动能力和探索行为改善。

3.2 CSP改善MCAO大鼠脑血流并减轻缺血性脑损伤

CSP组与MCAO组相比，患侧脑血流量显著增加，脑梗死体积显著减小。NeuN免疫组织化学显示，CSP组缺血半暗带中NeuN阳性细胞数量和阳性面积比例较MCAO组增加，表明神经元保留改善。Iba1免疫组织化学显示，CSP组Iba1阳性细胞密度降低，每个Iba1阳性细胞的突起分支数增加，提示小胶质细胞活化减轻。

3.3 CCK-8浓度筛选确定CSP工作浓度

在OGD处理的SH-SY5Y和BV-2细胞中，CSP在200 μg/mL浓度下表现出最佳的细胞活力恢复效果，因此选择该浓度作为后续体外实验的工作浓度。

3.4 KEGG和GO富集分析

三个缺血性脑卒中数据集的整合分析鉴定出57个差异表达基因，包括41个显著上调和16个显著下调的基因。GO和KEGG富集分析主要识别出与免疫应答和炎症反应相关的生物学过程和通路。KEGG通路分析显示IL-17和NF-κB信号通路显著富集。

3.5 GSEA富集分析

GSEA分析显示，IL-17信号通路（NES：2.1，校正p < 0.001）和NF-κB信号通路（NES：1.64，校正p = 0.02）在缺血性脑卒中组中均显著富集，表明这些炎症信号通路与缺血性脑卒中密切相关。

3.6 IL-17RA敲低提高OGD诱导的SH-SY5Y细胞活力

Western blot证实siIL-17RA组IL-17RA蛋白表达显著降低，敲低有效。在正常培养条件下，IL-17RA敲低对细胞活力无显著影响。在OGD条件下，OGD + siIL-17RA组的细胞活力显著高于OGD组，表明IL-17RA依赖性信号在缺血应激条件下特异性地参与细胞损伤。

3.7 CSP减轻MCAO相关的IL-17A和IL-17RA表达增加

免疫组织化学、Western blot和ELISA三种检测方法一致显示，MCAO组缺血半暗带中IL-17A和IL-17RA表达显著增加，而CSP组较MCAO组显著降低。

3.8 CSP对OGD处理的BV-2细胞中IL-17/NF-κB轴蛋白表达的影响

OGD显著增加了BV-2细胞中IL-17A、IL-17RA、ACT1、TRAF6、IL-1β和IL-6的表达，并提高了磷酸化p65/总p65比值。CSP处理显著降低了这些蛋白的表达和p-p65/p65比值。免疫荧光分析显示，CSP组IL-17RA荧光强度较OGD组显著降低。

四、讨论总结与研究结论

本研究证实了CSP在实验性缺血性脑卒中中的保护作用，并揭示了其与IL-17/NF-κB信号通路的相关性。CSP在pMCAO大鼠中改善了神经功能和行为结局，减轻了脑水肿和梗死体积，保护了神经元结构，并调节了缺血半暗带中的小胶质细胞反应。生物信息学分析、单细胞证据和IL-17RA敲低实验支持IL-17/NF-κB相关炎症信号在缺血样损伤中的参与。CSP给药与缺血脑组织中IL-17A和IL-17RA表达的降低以及OGD处理的BV-2细胞中IL-17/NF-κB相关炎症信号的减弱相关。

研究结果表明，CSP对实验性缺血性脑卒中的保护作用与IL-17/NF-κB相关神经炎症的减轻有关。这些发现为CSP的分子靶点进一步研究提供了实验基础。研究也存在一些局限性，包括未使用M1和M2相关标志物进一步检查小胶质细胞表型变化、未设置Sham + CSP组、以及IL-17RA敲低实验独立于CSP给药进行评估。未来结合CSP与IL-17RA敲低或过表达以及NF-κB活性的药理学调节的研究，可能有助于阐明IL-17/NF-κB信号在CSP相关保护中的贡献。

五、研究结论

本研究表