《International Journal of Molecular Sciences》：Postmortem Gene Expression and the Thanatotranscriptome: Postmortem Interval Estimation, Forensic Applications, and Future Perspectives
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死后分子变化远比细胞活动被动、均匀地终止更为复杂。人类及动物研究表明，某些RNA转录本在死后特定时间段内仍可被检测到，且转录本水平呈现组织依赖性和时间依赖性变化。这些死后RNA动态变化构成了死亡转录组（thanatotranscriptome）概念的基础，并可
死后分子变化远比细胞活动被动、均匀地终止更为复杂。人类及动物研究表明，某些RNA转录本在死后特定时间段内仍可被检测到，且转录本水平呈现组织依赖性和时间依赖性变化。这些死后RNA动态变化构成了死亡转录组（thanatotranscriptome）概念的基础，并可能为死后间隔（postmortem interval, PMI）估算提供分子层面的信息。已有研究报道，与凋亡、细胞应激、免疫应答及DNA损伤反应与修复通路相关的转录本丰度在死后发生变化。然而，所观察到的转录本水平可能反映生前RNA稳定性、选择性RNA降解以及潜在的残余转录活性的综合效应。一项基于人类血液的纵向研究报告，基于多转录本的PMI估算模型的均方根误差（root mean square error, RMSE）为4.75小时，体现了该方法的定量潜力。尽管如此，RNA谱可能受组织类型、温度、死亡原因及濒死过程、个体间生物学差异以及采样和储存条件的影响。方法学异质性及缺乏独立外部验证进一步限制了这些方法向常规法医学实践的转化。本综述批判性地评估了死后基因表达与RNA动态变化的分子基础、信使RNA（messenger RNA, mRNA）与微小RNA（microRNA, miRNA）生物标志物、基于转录组的PMI估算模型及其潜在法医学应用，特别强调标准化、独立验证及多生物标志物策略的必要性。
论文主体内容总结
1. 引言
准确估算死亡后经过的时间是法医学和法医病理学领域长期存在的基础性挑战之一。死后间隔（PMI）的估算对于可疑及涉及医疗法律纠纷的死亡事件的时间线重建至关重要。传统PMI估算方法包括尸冷、尸僵、尸斑等早期死后变化评估，以及各种物理、生化和形态学方法，法医昆虫学方法可用于更晚期的死后阶段。然而，这些方法的准确性受环境和个体因素影响，尚无单一方法能在整个死后期间保持高度准确性，因此PMI评估需要多参数综合解读。传统方法的局限性促使研究者日益关注更客观、可量化的PMI相关分子生物标志物，其中RNA稳定性、RNA降解及死后基因表达的时间依赖性变化成为研究热点。
2. 死亡转录组的概念
转录组指某一时刻细胞、组织或生物体内全部RNA转录本的集合。生物体死亡后，死后分子变化并非在所有细胞和组织中同步、均匀地发生。死亡转录组（thanatotranscriptome）广义上指生物体死亡后细胞和组织中可检测到的RNA转录本所构成的死后转录组谱。对该谱的解读需区分四个相关但概念不同的现象：RNA持久性与稳定性、RNA降解、差异转录本丰度以及潜在的死后转录活性。其中，转录本丰度的增加本身不足以证明新生RNA合成，因为差异稳定性和降解动力学可能产生类似的丰度模式。证实死后持续转录需要能够区分新合成RNA与既有转录本的独立实验证据，如代谢标记或新生RNA测序等方法，但其在人类死后组织中的适用性仍需专门验证。
3. 死后基因表达变化的生物学基础
死亡后循环和氧合停止导致组织缺氧和缺血、能量代谢紊乱及细胞稳态的逐步丧失。由于不同组织的代谢特征和对缺血的耐受性不同，死后分子变化的后果也因组织类型和死后间隔而异。斑马鱼和小鼠模型研究显示，死后转录组变化在时间上并非均匀分布，功能分析表明丰度增加的转录本涉及应激反应、免疫与炎症过程、凋亡、细胞转运、发育过程及表观遗传调控等功能。基于基因型-组织表达（GTEx）项目数据的大规模人类研究分析表明，死后间隔与RNA稳定性之间的关系具有显著组织特异性，死后基因表达变化不能仅用随机RNA降解解释。人类死后血液纵向研究也鉴定出具有不同时间模式的转录本组，早期死后变化与细胞存活和DNA损伤反应与修复过程相关。
4. RNA稳定性与死后RNA降解
RNA因化学结构原因比DNA更易发生水解断裂，同时易受核糖核酸酶酶促降解。RNA稳定性还受温度、pH、离子条件、RNA二级结构及RNA-蛋白质相互作用影响。死后RNA完整性随时间下降的过程既非线性也非均匀，不同RNA种类以及同一RNA类别中的单个转录本可能表现出不同的稳定性特征，同一转录本的降解动力学也可能因组织而异。基于GTEx数据对15种人类组织类型的研究表明，PMI相关的表达变化具有显著的组织和基因特异性，中枢神经系统组织的mRNA谱相对更稳定，而某些胃肠组织表现出更明显的死后变化。人类牙髓因其解剖位置受到保护，被研究用于较长PMI的估算，多标志物模型比单转录本模型具有更好的拟合度和预测性能。温度是影响死后RNA降解的重要因素，此外组织类型、死亡原因和濒死过程、采样时间和方法、储存条件、RNA分离和定量方法及标准化策略均可能影响测得的死后RNA谱。
5. 不同组织中的死亡转录组
血液是死亡转录组研究中的重要生物材料。早期研究表明死后血液中mRNA降解与PMI相关，而更大规模的转录组分析显示死后血液中的分子变化比简单均匀的RNA降解过程更为复杂。纵向人类血液研究鉴定出丰度随时间增加或减少的转录本组，基于30个转录本的弹性网络模型在10次重复五折交叉验证中报告了4.75小时的均方根误差（RMSE），但该模型倾向于高估较低PMI值并低估20小时以上的数值。肝脏研究中，凋亡相关基因的死后表达谱显示mRNA在死后48小时内仍可检测，且死后RNA变化并非所有转录本均呈单向均匀降解。肝特异性RNA生物标志物的靶向RNA测序研究还展示了死后组织来源鉴定的潜力。前列腺因在人体遗骸中分解相对延迟而受到关注，84个凋亡相关基因的研究表明mRNA转录本在死后5天内仍可检测，总RNA测序研究进一步鉴定了高低PMI样本间的差异表达模式和可变剪接事件。脑组织研究显示，死后脑转录组变化并非简单反映均匀RNA降解，而是呈现细胞类型和转录本特异性动力学，神经元活性相关转录本快速选择性下降，而星形胶质细胞和小胶质细胞相关基因相对增加。
6. 死亡转录组学与死后间隔估算
RNA-based PMI估算策略主要分为两类：一是考察特定转录本的死后稳定性和降解动力学，二是同时评估多个转录本以建立PMI估算的多变量模型。多转录本模型有潜力减少单个转录本受生物学和环境变异影响的局限性，但单纯增加转录本数量并不必然提高预测性能。在高维转录组数据集中，变量选择、过拟合、模型校准和独立外部验证是关键的方法学考量。基于GTEx项目7105个样本的分析表明死后基因表达变化具有显著组织特异性，皮肤和皮下脂肪等易获取组织可能为估算死亡时间提供信息。然而，当前模型的可推广性仍是主要关切，模型性能受组织类型、解剖采样部位、温度、死亡原因和濒死过程、PMI范围、个体间生物学差异、采样和储存条件以及RNA分离和标准化方法等多种因素影响。
7. mRNA在PMI估算中的应用
信使RNA（mRNA）是死后分子研究中最广泛研究的RNA种类之一，尤其被评估为早期死后间隔估算的潜在生物标志物。定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）是最常用的mRNA分析方法之一，RNA测序（RNA-seq）则可同时分析大量转录本。系统综述显示，ACTB和GAPDH是PMI研究中研究最频繁的mRNA标志物，但其死后行为可能因组织类型、温度和实验条件而异。标准化是mRNA-based PMI研究中的主要方法学挑战之一，常用参考基因在死后条件下需要专门验证，参考基因稳定性具有组织依赖性。GAPDH、U6和18S rRNA在研究条件下表现出较广泛的适用性，而ACTB和B2M的可靠性仅限于心脏组织。不恰当的标准化策略可能导致对目标转录本真实死后变化的误读。
8. miRNA在PMI估算中的应用
微小RNA（miRNA）是约18–24个核苷酸的小型非编码RNA分子，参与基因表达的转录后调控。某些miRNA在死后条件下相对较高的稳定性使其在法医学研究中受到关注。系统综述表明，某些miRNA在死后期间保持可测量性并可能呈现PMI相关变化，miRNA在PMI估算和死后RNA分析标准化方面均具有潜力，但其稳定性因具体miRNA和组织而异。人类骨组织样本研究显示let-7e和miR-16的表达水平与PMI增加呈负相关，提示骨组织中miRNA可能作为较长死后间隔的潜在生物标志物。然而，死后miRNA稳定性不能在所有miRNA和组织中一概而论，miRNA评估还需要适合短RNA分子的方法学策略。
9. 死亡转录组研究中使用的分子方法
RT-qPCR和RNA测序（RNA-seq）是研究死后转录组变化的主要分子方法。RT-qPCR是高度灵敏的方法，能够对预定义的RNA转录本进行靶向定量评估，但仅限于预先选择的靶转录本，且测量可靠性可能受RNA完整性、引物设计、参考基因选择和标准化策略等影响。RNA-seq能够同时大规模分析大量转录本，是表征死后转录组和发现新型候选生物标志物的重要工具，但样本和文库制备、测序参数、生物信息学数据处理流程和标准化方法的差异可能影响研究间的可比性。适当的标准化策略和RNA质量评估对获得可靠可重复的定量结果至关重要，常用参考基因不应被假定在死后样本中固有稳定，RNA完整性指标应与目标转录本的时间依赖性行为和分析方法特征结合解读。
10. 死亡转录组的潜在法医学应用
死亡转录组分析除PMI估算外，在确定组织来源和死亡原因及机制的分子表征方面也具有潜在应用。PMI估算是研究最广泛的法医学应用，统计和机器学习模型可实现对PMI的定量估算，但当前模型对组织类型、PMI范围、样本特征和研究条件的依赖性限制了其可推广性。组织特异性死后转录谱可能用于生物样本组织来源的分子鉴定，肝组织研究证明即使在较长死后间隔下组织特异性转录组生物标志物仍可检测。死后转录组可能反映死亡过程中发生的生物学反应相关的分子变化，包括缺氧、缺血、炎症、细胞应激和凋亡等。心肌组织和脑组织研究分别显示某些转录本在死亡原因组间存在表达差异，支持死后mRNA分析可能为早期心肌缺血评估等提供补充分子信息。然而，这些分子变化不应被假定对特定死亡原因具有特异性，转录组学发现应结合尸检、组织病理学、毒理学及其他案件特定法医学证据综合解读。
11. 死亡转录组的局限性
温度是影响死后RNA稳定性和降解动力学的主要环境因素之一，在受控实验条件下开发的PMI模型直接应用于不同环境条件的案件可能导致不准确或误导性估算。PMI还应与样本采集到实验室分析之间的分析前间隔相区分。死后RNA行为在组织和转录本间均存在差异，同一转录本在不同组织间可能呈现不同的死后动力学，这使开发适用于所有组织类型和广泛PMI范围的单一通用转录组模型变得复杂。死亡原因和濒死过程可能影响死亡时的基线转录组谱，个体间生物学变异也是影响模型性能的因素，基因型与PMI的交互作用支持在异质性人类队列中验证模型的必要性。随着PMI增加，进行性自溶和RNA降解可能使分子分析复杂化，早期死后期间开发的模型不应直接外推至延长死后间隔或分解阶段。方法学异质性和缺乏独立外部验证是转化研究的主要障碍，模型性能不仅应通过相关性或拟合优度评估，还应报告预测误差和量化预测不确定性的指标。
12. 从单一生物标志物到多转录本模型
死后RNA行为在组织、转录本和环境条件下的变异性使单一生物标志物用于PMI估算变得复杂。多转录本模型可整合不同mRNA和miRNA标志物与转录本稳定性或降解的度量，在适当数据集中还可纳入温度等PMI相关环境变量。人类研究已证明该方法的可行性，弹性网络回归和梯度提升等计算方法已用于整合多转录本数据。然而，增加模型变量数量并不必然提高预测性能，在样本量有限且变量数量庞大的转录组数据集中，过拟合风险尤为突出。从法医学角度看，首要目标不仅是开发在训练数据集中表现良好的模型，而是建立在不同个体和环境条件下具有已验证可推广性且预测不确定性得到定量表征的模型。
13. 死亡转录组学的未来方向
未来研究的主要目标应是将生物学信号转化为可靠、可重复、可推广的法医学模型，需要建立涵盖生物标志物发现、分析验证、模型开发和独立外部验证的系统性研究框架。建立大型独立人类队列是优先事项之一，研究设计应充分代表不同PMI范围、死亡原因、环境条件和个体间生物学变异，同一个体多个组织的比较研究有助于解释个体间变异。标准化是转化研究的基本前提，采样、运输、储存、RNA分离、RNA质量评估和标准化程序的协调对提高研究间可比性和可重复性至关重要。从单转录本方法向多转录本panel的转变是重要方向，整合mRNA和miRNA等不同RNA种类的互补分子信息与组织类型、温度等相关变量可能更好地捕捉死后过程的生物学异质性。未来模型应在独立数据集和真实法医案件系列中进行外部验证，采用多中心设计、标准化分析前程序和预定义开发与验证队列，并评估转录组模型相对于既有法医方法的增量价值。
14. 讨论
现有证据表明死后转录组不能仅被视为被动均匀RNA降解的产物。虽然整体生理功能随生物体死亡而终止，但不同组织中的细胞和分子过程并非同时终止。测得的死后RNA谱可能反映生前合成转录本的稳定性、选择性RNA降解以及潜在残余转录过程的综合效应。人类研究已证明死后基因表达变化取决于组织类型、基因以及某些情况下的个体间生物学特征。尽管大量证据表明转录组数据可提供PMI估算相关的定量信息，但单一总体性能指标不足以确立法医学适用性，模型评估应考虑整个PMI范围内的误差分布和个体预测相关的不确定性。死亡原因和濒死过程相关的缺氧、缺血、炎症和细胞应激反应可能影响死亡时的基线转录组谱，温度应在预测建模中作为模型变量或通过不同热条件下的温度特异性模型开发予以明确考虑。分析变异性是另一重要局限，常用参考基因不应被假定在死后条件下固有稳定，参考基因稳定性和数据表示方式的选择可能影响RT-qPCR-based PMI模型的预测性能。
15. 结论
死亡转录组研究显示死后RNA谱不仅反映被动均匀降解，还可能呈现随组织、转录本和时间变化的动态变化。人类研究证据支持这些分子变化具有提供PMI相关定量信息的潜力，并可将多转录本数据纳入PMI估算模型。然而，死亡转录组目前不应被视为精确的“分子时钟”或独立的死亡时间确定方法。组织和转录本异质性、环境和生物学变量、分析前和分析变异性、方法学标准化缺乏以及有限的外部验证目前限制了这些方法向常规法医学实践的转化。因此，死亡转录组当前最现实的法医学角色不是独立确定死亡时间，而是为PMI评估提供补充性和定量化的分子信息层面，未来研究应确定此类模型能否在真实法医学环境中产生可重复且具有法医学相关性的PMI评估改进。
