染色质相关RNA（caRNA）互作网络的解码：从全基因组动态捕获到动植物表观遗传机制

《Epigenetics》：Decoding chromatin-associated RNA (caRNA) interaction networks: from genome-wide dynamic capture to epigenetic mechanisms in plants and animals

染色质相关RNA（caRNA）作为细胞核内的调控中枢，参与转录稳态、染色质重塑和跨代遗传等关键生物学过程。近年来，多种全基因组RNA-染色质互作捕获技术的发展，使得高精度解析caRNA与染色质之间的空间互作网络成为可能。本综述系统阐述了caRNA的概念、功能及其与染色质的互作模式，全面概述了靶向和非靶向鉴定技术的原理、特点、技术偏向性及适用场景。在此基础上，本文从四个功能维度对动物和植物中的caRNA调控机制进行了比较分析：三维染色质拓扑结构的组织、RNA修饰介导的表观遗传调控开关、环境与跨代信号的传递，以及caRNA网络失调相关的病理机制。通过这一比较分析，本文揭示了动物与植物中caRNA介导的功能调控的共同特征及谱系特异性适应策略，并讨论了该领域在单细胞分辨率、人工智能辅助数据分析及转化应用等方面面临的挑战与未来方向。

引言

依据经典分子生物学的中心法则，遗传信息由DNA传递至RNA再传递至蛋白质。然而，真核生物基因组中不到2%的转录本编码蛋白质，其余绝大多数为非编码RNA（ncRNA）。在细胞核内，存在一类与染色质形成稳定物理相互作用的RNA分子，称为染色质相关RNA（caRNA）。近年研究表明，caRNA在转录调控、染色质高级结构维持、基因组稳定性及跨代遗传等过程中发挥核心作用。由于染色质在核内高度折叠，且RNA与染色质的相互作用具有动态性和瞬时性，传统生化方法难以在全基因组范围内高分辨率地捕获这些互作。过去十年间，基于邻近标记、靶向富集和深度测序的多组学技术快速发展，使研究人员能够系统绘制RNA-染色质互作图谱。本综述旨在填补现有研究中缺乏对动物与植物间caRNA调控机制普遍性或特异性策略的系统总结这一空白，采用比较框架，批判性地评估R-loop形成、相分离凝聚体形成及m⁶A依赖性染色质招募等常见机制维度在进化过程中的保守性与分化。本综述旨在系统总结caRNA领域的鉴定技术创新与跨物种调控机制，首先阐明caRNA的核心概念与空间互作模式，全面描述当前主流的靶向与非靶向鉴定技术并提供方法学比较与适用性指南，在此基础上综合分析动物模型中caRNA互作网络的病理机制与跨代遗传，以及植物模型中环境适应与昼夜节律的调控机制，最后讨论该领域面临的技术瓶颈并展望未来发展方向。

caRNA的概念与功能

caRNA的概念与分类：超过75%的人类基因组被转录，但其中不到1.5%的区域编码蛋白质。ncRNA包含snoRNA、snRNA、miRNA、lncRNA和eRNA等多种类别。细胞核内含有大量转录后未出核的RNA分子，它们稳定而紧密地结合于染色质，这类分子统称为染色质相关RNA（caRNA）。caRNA并非单一的分子亚群，而是包含多种生物类型的转录本集合，既包括mRNA也包括ncRNA；共转录阶段的新生前体mRNA占caRNA总量的90%以上，其余约10%为ncRNA。前体mRNA来源的caRNA构成多样，包括基因内反义转录本、启动子上游转录本（PROMTs）以及部分剪接或未剪接的前体。特定前体mRNA也可作为非编码结构性RNA发挥作用，调节局部染色质状态。长链非编码RNA（lncRNA）长度超过200 nt，因其长序列可作为高度模块化的分子支架，连接不同的表观遗传修饰酶并将其精准递送至特定基因组靶点。小核RNA（snRNA）和小核仁RNA（snoRNA）是真核细胞核内两类重要的ncRNA，分别在前体mRNA剪接和RNA化学修饰引导中发挥不可替代的作用。增强子RNA（eRNA）由活性增强子的双向转录产生，长度约为50至2000个核苷酸，通过增强子与靶基因之间的三维染色质环化招募BRD4等蛋白，激活转录过程。启动子反义RNA（paRNAs）通过稳定组蛋白去甲基化酶KDM4B和KDM4C来调控启动子区域的染色质状态。

caRNA与染色质的互作模式：caRNA与染色质的结合主要涉及三种模式：直接的RNA-DNA碱基配对，即caRNA通过序列互补性与基因组DNA形成R-loop或三螺旋结构实现序列特异性的物理结合；蛋白质介导的相互作用，即caRNA作为支架分子招募染色质结合蛋白复合物间接锚定于特定染色质区域；核区室内的空间邻近效应，此类关联主要通过邻近技术捕获，检测结果反映RNA与DNA在核内的空间邻近而非直接物理接触。在基因组层面，caRNA根据其对靶位点的调控范围可分为三类：顺式作用、反式作用和顺反协同作用。顺式作用中，caRNA通常通过直接RNA-DNA碱基配对的分子结合机制，在转录位点附近通过形成R-loop进行自我锚定。区分生理性与病理性R-loop的关键在于细胞是否维持稳态。反式作用中，caRNA的分子结合机制通常依赖蛋白质介导的相互作用，caRNA作为支架招募染色质修饰复合物并将其引导至远端基因组位点。顺反协同作用整合了这两种分子机制，caRNA先通过R-loop或蛋白质介导机制在转录位点附近顺式锚定，随后通过招募蛋白复合物沿同一条染色体长距离扩散以实现反式调控。

识别RNA-染色质互作的技术

靶向识别技术：根据锚定类型分为两类。一类以特定RNA分子为目标，包括利用生物素标记的反义探针与目标RNA杂交并捕获与之互作的染色质DNA复合物的ChIRP-seq和CHART-seq；另一类以特定基因组区域、DNA结合蛋白或组蛋白修饰为目标，包括基于ChIP靶向特定蛋白或修饰的ChRD-PET，以及TaDRIM-seq。ChIRP-seq通过生物素标记的反义寡核苷酸探针结合目标RNA，捕获与其互作的DNA片段并进行高通量测序。CHART-seq在探针设计中引入RNase H敏感性测定以精确定位目标RNA上的高可及区域，减少脱靶效应。ChIRP-MS和CHART-MS将RNA靶向捕获与质谱联用以同时鉴定目标RNA结合的蛋白质网络。HiChIRP进一步将ChIRP与Hi-C结合，以特定目标RNA为锚点解析其介导的三维染色质互作网络。ChRD-PET使用针对组蛋白修饰的抗体锚定特定基因组区域，捕获与之物理结合的RNA分子并通过生物素标记的DNA桥接头进行原位邻近连接。TaDRIM-seq使用Protein G-Tn5转座酶靶向特定染色质区域，插入测序接头后通过原位邻近连接同时捕获DNA-RNA和RNA-RNA互作。

非靶向识别技术：主要包括GRID-seq、iMARGI、RADICL-seq、ChAR-seq和Red-C。GRID-seq采用双功能接头，一端连接双链DNA，另一端连接单链RNA，在限制性内切酶消化染色质后将空间邻近的RNA和DNA分子共价连接。iMARGI将邻近连接反应从体外磁珠移至完整细胞核内原位进行，减少体外操作引起的结构变化。RADICL-seq利用RNase H酶特异性消化转录活跃区的RNA-DNA杂合链，降低新生转录本和rRNA造成的背景噪音。ChAR-seq使用5'-腺苷酰化的单链DNA桥接头，通过突变型T4 Rnl2tr酶将RNA的3'端连接至片段化染色质DNA，形成不对称极性的RNA-寡核苷酸-DNA嵌合片段。Red-C使用DpnII限制性内切核酸酶消化染色质并引入特定桥接头，直接将RNA分子的3'端与片段化DNA连接。RedChIP将Red-C与染色质免疫沉淀（ChIP）结合，绘制与多梳抑制元件和拓扑边界相关的非编码RNA图谱。

动植物功能保守性与特异性的比较分析

caRNA作为三维染色质拓扑结构的组织者：在动物系统中，caRNA在三维染色质结构中发挥关键作用。长链非编码RNA Xist以依赖于三维染色质拓扑的方式顺式锚定于失活X染色体（Xi），通过招募PRC2复合物催化抑制性H3K27me3修饰，实现整条X染色体的转录沉默。caRNA还参与TAD内部和增强子-启动子环的局部拓扑调控。在植物模型中，最典型的caRNA参与染色质拓扑的机制是RNA指导的DNA甲基化（RdDM）通路，Pol V转录的长链非编码支架RNA持续结合染色质，作为AGO4-siRNA复合物的分子锚点，招募从头DNA甲基转移酶DRM2催化靶位点DNA甲基化。ChRD-PET技术在构建水稻高分辨率RNA-DNA互作图谱中证实caRNA广泛参与染色质环和空间染色质互作域的形成。动物与植物的共同之处在于均利用caRNA作为三维染色质结构的支架，但在已报道的作用尺度上存在显著差异，动物中caRNA参与染色质拓扑调控的证据涵盖整条X染色体至TAD内部和增强子-启动子环等多个层次，而植物中目前明确建立的caRNA介导的拓扑调控主要局限于局部染色质环。

m⁶A修饰作为染色质调控的保守开关：m⁶A修饰在染色质相关RNA上也高度富集并在表观遗传调控中发挥重要作用。在动物中，METTL3催化染色质相关调控RNA（carRNAs）上共转录沉积m⁶A，核内m⁶A阅读蛋白YTHDC1识别该修饰并特异性促进carRNAs的核内降解。m⁶A修饰的caRNA可作为分子支架介导异染色质形成和转录沉默，YTHDC1通过识别并结合lncRNA XIST上的m⁶A促进X染色体转录抑制。在植物中，拟南芥COOLAIR-FCA-FLD通路中，冷诱导下长链非编码RNA COOLAIR在FLC位点形成R-loop，RNA结合蛋白FCA与辅因子FLL2促进COOLAIR上的m⁶A修饰，增强FCA结合并促进FLL2依赖的凝聚体形成，最终导致靶基因FLC的原位染色质沉默。尽管m⁶A修饰的核心功能在物种间高度保守，但其下游的分子读取和效应机制表现出显著的谱系特异性，动物主要依赖YTHDC1作为核内m⁶A识别和效应平台，而植物独立进化出以CPSF30-L和ECT家族蛋白为代表的独特阅读蛋白系统。

caRNA在环境与跨代遗传中的作用：在动物精子中，一类独特的“DNA相关RNA”（DRNA）以R-loop形式紧密锚定于父本基因组，携带父源环境记忆。成熟精子核内保留多种功能性RNA，环境因素可直接重塑精子caRNA表达谱，特定caRNA结构可绕过早期合子表观遗传重编程将表观信号传递给卵母细胞，介导父系性状的跨代遗传。在植物中，caRNA快速响应昼夜节律和季节变化，整合不同时间尺度的环境信号以驱动发育程序的可塑性。TaDRIM-seq技术发现水稻染色质环锚定区域存在随光周期显著变化的caRNA互作网络，核心昼夜节律基因OsLHY仅在早晨形成高密度RNA-RNA互作网络。动物与植物均利用caRNA作为环境信息的载体，但两者在信息传递的时间尺度和方向上存在显著差异，动物通过精子DRNA实现跨代传递，而植物更依赖于对当前环境条件的持续响应。

caRNA网络失调与疾病发生：caRNA互作网络稳态的维持是染色质功能的前提，其破坏导致基因表达失调和基因组不稳定。在动物癌症中，caRNA网络异常可分为四种类型：增强子-启动子拓扑结构破坏、R-loop积累与基因组不稳定、染色质修饰复合物异常招募、DNA损伤修复干扰。在植物中，尽管缺乏直接对应癌症的病理状态，但胁迫条件下caRNA网络失调同样引发基因组不稳定和发育异常。高温可导致Pol V活性受抑和siRNA水平下降，引起ONSEN等转座子的跨代激活；氧化胁迫下R-loop稳态被破坏，RNase H或解旋酶突变导致异常R-loop积累触发DNA复制停滞和双链断裂。动物与植物共享caRNA功能的核心逻辑：利用RNA作为动态支架在特定时空条件下招募染色质修饰复合物，区别在于动物侧重于发育编程和疾病相关过程，植物则侧重环境感知和胁迫适应。