基于LC–MS的Excoecaria agallocha叶提取物代谢物谱分析：抗氧化、抗炎、胆碱酯酶抑制及AChE靶向分子对接的神经保护评价

《Molecules》：LC–MS-Based Metabolomic Profiling of Excoecaria agallocha Leaf Extract: Integrated Antioxidant, Anti-Inflammatory, Cholinesterase Inhibitory and Neuroprotective Evaluation with AChE-Targeted Molecular Docking

　　

Excoecaria agallocha L.是一种药用重要红树物种，含有多样次生代谢物，具有潜在抗氧化、抗炎和神经保护活性。研究人员调查了E. agallocha叶采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和水提取物的多功能生物潜力。初步植物化学筛选揭示溶剂依赖性成分分布，同时在甲醇和水提取物中定量了总酚和总黄酮含量。使用DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼基）自由基清除和铁还原抗氧化能力（FRAP）测定评估抗氧化活性，使用蛋白变性抑制和COX-2（环氧合酶-2）抑制测定评估抗炎活性，分别以阿司匹林和塞来昔布为参考标准。在L929正常成纤维细胞中评估甲醇和水提取物的细胞毒性，并在暴露于TMT（三甲基锡）的SK-N-SH神经母细胞瘤细胞中评估神经保护活性，水提取物在TMT暴露前1 h给药。使用AO/EB（吖啶橙/溴化乙锭）双荧光染色评估凋亡改变。以加兰他敏为参考抑制剂测定AChE（乙酰胆碱酯酶）抑制。采用LC–MS（液相色谱–质谱）对水提取物进行推定代谢物谱分析，随后对选定鉴定化合物针对人AChE（PDB ID 7E3D）进行AChE靶向分子对接，并进行基于ProTox-II的计算机毒性预测。水提取物显示最高总酚（717.81 μg/g）和总黄酮（485.16 μg/g）含量，相比甲醇提取物（分别为562.43和334.00 μg/g），并表现出提取物中最强DPPH自由基清除活性（IC₅₀ = 115.49 μg/mL），同时具有明显铁还原能力。水提取物还表现出显著COX-2抑制（IC₅₀ = 39.77 μg/mL），而甲醇提取物显示更强的蛋白变性抑制（IC₅₀ = 138.89 μg/mL）。水提取物对L929细胞显示相对低毒性，并显著减弱TMT诱导的SK-N-SH细胞毒性，最低预处理浓度（20 μg/mL；92.14 ± 1.77%细胞活力 vs 单独TMT 16.92 ± 1.55%）观察到最大保护。水提取物对AChE的抑制呈浓度依赖性增加，IC₅₀为55.64 μg/mL。与此一致，AO/EB染色表明水提取物预处理后活细胞比例增加，凋亡细胞群减少。LC–MS谱分析揭示化学多样的推定鉴定代谢物。AChE靶向分子对接推定鉴定6-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-chromen-4-one和daidzein显示相对有利的对接谱以及Class 5预测毒性。总体而言，当前发现表明E. agallocha叶提取物在研究实验条件下具有可测量的抗氧化、抗炎、胆碱酯酶抑制和神经保护相关活性，水提取物显示相对显著活性。这些发现提供初步实验和计算证据，支持进一步生物测定引导的分离、单个化合物的实验验证、机制研究和体内评价，以确定E. agallocha的神经保护潜力和生物学相关性。

研究背景方面，植物因特化代谢产生结构多样分子，可作为治疗剂来源；与单分子合成药不同，植物提取物含酚类、黄酮、萜类、生物碱、固醇、木脂素及相关代谢物，可通过互补的抗氧化、抗炎、酶调节和细胞保护机制作用于多靶点。氧化应激、炎症、线粒体功能障碍和神经元损伤并存于多因素疾病。红树植物因高盐、潮汐淹没、氧限制和强辐射等胁迫，产生保护性次生代谢物。Excoecaria agallocha L.（大戟科）俗称blind-your-eye mangrove，传统用于风湿、癫痫、溃疡、瘫痪和炎症性疾病；其叶、皮、茎、根含二萜、三萜、黄酮、固醇和酚类。已有综述报道该物种超过235种植物成分，并具抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗惊厥等活性；从E. agallocha分离的二萜还显示抗神经炎症活性。神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病涉及氧化应激、神经炎症、线粒体功能障碍、蛋白聚集、胆碱能障碍和神经元凋亡。常规药物受毒性、剂量依赖不良反应和单靶点局限，因此研究人员开展E. agallocha叶的整合评价，关注抗氧化、抗炎、COX-2抑制、AChE抑制、细胞相容性和TMT相关细胞保护，并进行LC–MS代谢物谱分析和AChE靶向分子对接。研究得出，水提取物在多项实验中活性较突出，LC–MS显示化学多样性，对接提示6-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-chromen-4-one和daidzein具有较好预测对接结果，这为后续分离、验证和体内评价提供初步依据。

关键技术方法方面，研究人员采集印度卡纳塔克邦Karwar的Sadashivghad新鲜成熟叶，经Dr. Haleshi C鉴定，凭证号HDUD533；以不同极性溶剂经Soxhlet制备提取物。L929正常成纤维细胞和SK-N-SH神经母细胞瘤细胞购自National Centre for Cell Line Studies（NCCS），Pune, Maharashtra, India。主要方法包括植物化学筛选、Folin–Ciocalteu法总酚和AlCl₃法总黄酮定量、DPPH和FRAP抗氧化、BSA蛋白变性抑制、COX-2抑制、MTT细胞毒性、TMT神经保护、AO/EB双染、Ellman法AChE抑制、LC–MS谱分析、SwissADME、ProTox-II毒性和AutoDock Vina对接PDB ID 7E3D；统计采用双因素或单因素ANOVA及相应多重比较。

研究结果按原文小标题概括如下。2.1 植物化学筛选及总酚、总黄酮含量：石油醚提取物仅检出植物固醇，甲醇和水提取物检出酚类、黄酮和萜类；水提取物总酚717.81 μg/g、总黄酮485.16 μg/g，高于甲醇提取物562.43和334.00 μg/g，提示水提物富集极性抗氧化成分。2.2 DPPH自由基清除活性：各提取物呈浓度依赖性，水提物IC₅₀ = 115.49 μg/mL，强于甲醇146.01、乙酸乙酯199.31和氯仿249.64 μg/mL，抗坏血酸为77.53 μg/mL，结论为水提物清除能力最强。2.3 铁还原抗氧化能力：FRAP中水提物还原能力最强，排序为水 > 甲醇 > 乙酸乙酯 > 氯仿，与DPPH结果一致。2.4 基于蛋白变性的抗炎活性：甲醇提取物蛋白变性抑制最强，IC₅₀ = 138.89 μg/mL，其次为水158.44、乙酸乙酯189.88和氯仿209.25 μg/mL，阿司匹林为96.88 μg/mL，说明活性不能仅由总酚预测。2.5 COX-2抑制活性：水提物最强，IC₅₀ = 39.77 μg/mL，接近塞来昔布34.94 μg/mL；甲醇45.39、氯仿80.40、乙酸乙酯97.23 μg/mL，结论为水提物具有明显COX-2抑制。2.6 L929正常成纤维细胞毒性：ME和WE均浓度依赖性降低细胞活力，WE的IC₅₀ = 184.79 μg/mL高于ME的160.50 μg/mL，顺铂15 μg/mL仅11.79%活力，提示水提物相对低毒。2.7 对TMT诱导SK-N-SH细胞损伤的神经保护：水提物在TMT前1 h给药，20 μg/mL时活力92.14 ± 1.77%，显著高于单独TMT的16.92 ± 1.55%，更高浓度活力下降，结论为显著但未明确机制的保护。2.8 TMT挑战SK-N-SH细胞的形态学神经保护证据：TMT处理细胞形态明显改变，水提物预处理组形态较好，尤其低浓度，与活力结果一致。2.9 水提物对TMT神经毒性的抗凋亡作用：AO/EB染色中未处理细胞呈亮绿色，TMT组黄、橙、橙红色并核浓缩、碎片化；水提物20 μg/mL组绿色增多、橙红减少，结论为定性支持抗凋亡，但未定量评分。2.10 抗AChE活性：水提物浓度依赖性抑制AChE，20–100 μg/mL抑制率34.63%至67.13%，IC₅₀ = 55.64 μg/mL；加兰他敏IC₅₀ = 28.55 μg/mL，说明水提物有抑制但约为参考药两倍弱。2.11 LC-MS化学谱分析：水提物推定注释吲哚相关物、1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid、甲氧基酚相关物、campesterol、甲基化黄酮、dihydrosphingosine、rosin、儿茶酚相关物、木脂素糖苷、daidzein和苯丙素相关物，提示化学多样性可解释多功能活性，但注释需标准品和MS/MS确认。2.12 已鉴定化合物ADMET特征：分子量101.10至400.68 g/mol，氢键特征差异大，部分化合物胃肠吸收较好，疏水物溶解度较差，提示候选物需多维评价。2.13 预测急性毒性：ProTox-II预测LD₅₀为225至5000 mg/kg，约22倍差异；1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid和rosin为5000 mg/kg、Class 5；6-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-chromen-4-one为4000 mg/kg、Class 5；daidzein为2430 mg/kg、Class 5；campesterol为890 mg/kg、Class 4。2.14 针对人AChE 7E3D的分子对接：七个化合物中，6-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-chromen-4-one对接分数?6.9 kcal/mol最强，campesterol和daidzein为?6.8 kcal/mol；涉及Trp86、Tyr337、Phe338、Ser203、Glu334和His447等。结论为6-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-chromen-4-one在对接和毒性预测上较平衡，daidzein也有希望，但均属计算预测而非实验结合或疗效证明。

讨论部分总结认为，E. agallocha叶水提物具有较强抗氧化、COX-2抑制、AChE抑制和TMT损伤保护，且与其较高酚类和黄酮含量相符；不同溶剂富集不同成分，甲醇在蛋白变性抑制中更强，说明活性不能仅凭总酚预测。现有证据与既往关于E. agallocha抗氧化、抗炎、抗惊厥和抗神经炎症的报道一致，但当前研究未建立AChE抑制与TMT保护之间的因果机制，AO/EB为定性观察，LC–MS为推定注释，ADMET、毒性和对接均为计算预测，因此仍需分离单体、机制实验和体内评价。结论部分翻译如下：本研究表明Excoecaria agallocha L.叶具有潜在抗氧化、抗炎、COX-2抑制、AChE抑制和神经保护活性。在测试提取物中，水提取物表现出良好的体外抗氧化、COX-2抑制和神经保护作用，这与其相对较高的酚类和黄酮含量相关。水提取物还显著抑制AChE并保护SK-N-SH细胞免受TMT诱导的细胞毒性，提示潜在多功能神经保护作用。LC-MS谱分析揭示多样推定鉴定代谢物，可能有助于观察到的生物活性。总体而言，这些发现支持E. agallocha叶作为多功能生物活性化合物的潜在来源。在计算机分析评价的化合物中，6-hydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-chromen-4-one和daidzein表现出有利的预测结合相互作用，并在计算机毒性预测分析中归类为Class 5。这些发现将这些化合物鉴定为进一步研究的有兴趣潜在成分；然而，对接和毒性结果是计算预测，并不确立其生物活性、安全性或机制相关性。因此，需要使用分离化合物进行实验验证，以确定它们对观察到的药理活性的贡献。