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递归剪接位点（recursive splice sites）是假定的罕见基序，被认为可促进跨越巨大内含子的剪接并塑造异构体多样性。递归剪接（recursive splicing, RS）的必要性及其在人类疾病中的作用尚未得到证实。在此，研究人员利用CRISPR
递归剪接位点（recursive splice sites）是假定的罕见基序，被认为可促进跨越巨大内含子的剪接并塑造异构体多样性。递归剪接（recursive splicing, RS）的必要性及其在人类疾病中的作用尚未得到证实。在此，研究人员利用CRISPR模拟消除CADM2中一个RS位点（RS1）并赋予注意力缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder, ADHD）及其他神经行为性状风险的内含子缺失。在人诱导神经元中消融RS1改变了CADM2第一内含子上的RNA丰度梯度，降低了CADM2表达，并影响转录本使用。CADM2表达降低反映为RS1下游外显子使用减少以及参与神经元过程的基因的全局改变。携带Cadm2 RS1缺失的体内啮齿动物模型表现出对Cadm2表达的减弱效应以及行为和功能性脑连接的适度变化。该研究证明RS是与一系列神经精神及行为性状相关基因中的一种非编码调控机制。
经典剪接突变常被遗传关联研究调查，但递归剪接（recursive splicing, RS）尚未被证实与人类疾病相关。RS也称zero-exon splicing，最初在果蝇中发现，通过两步去除长内含子：RS位点先作为3′受体剪接位点去除第一段内含子，随后重建5′供体剪接位点，去除第二段内含子和递归外显子（recursive exon, RE）。RS在人类仅少数长脑表达基因中报道，其必要性及在人类疾病中的作用未明。研究人员近期在950,278名个体54类主要神经疾病中分析基因组拷贝数变异（copy-number variants, CNVs），发现CADM2第一内含子中一组罕见约100 kb杂合缺失与注意力缺陷多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder, ADHD）及其他神经行为性状风险相关。CADM2编码脑表达突触细胞黏附分子，且其常见变异反复与ADHD、冲动和药物/酒精使用等相关。CADM2是少数使用RS的人类基因，这些内含子缺失去除RS位点而不影响编码序列。因此，研究人员通过建模CADM2中RS改变，旨在证明RS的功能作用并阐明与神经行为性状分子结构相关的疾病生物学。
方法上，研究人员用CRISPR在人类诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）中构建CADM2 RS1缺失或倒位的等位系列，并分化为Ngn2诱导谷氨酸能神经元（induced neurons, iNs）；分析gnomAD 63,046人和All of Us 84,247人全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）结构变异，并参考既往950,278人罕见拷贝数变异（rare copy-number variants, rCNVs）队列；采用总RNA-seq、靶向Capture-Seq、qPCR、DEXSeq、de novo转录本重建、差异表达和富集分析；在大鼠中CRISPR删除Cadm2 RS1，进行qPCR、行为学与功能性磁共振成像（functional MRI, fMRI）。
CADM2递归剪接位点缺失的进一步表征：在rCNV调查中，163个位点显著关联疾病，其中12个不重叠已知蛋白编码序列；CADM2第一内含子罕见缺失与ADHD强关联（meta-analysis lnOR 3.44），并与双相障碍等名义关联。gnomAD WGS发现4个不同CADM2 RS1内含子缺失等位，总AF 7.14e-5；All of Us发现5个，其中2个匹配gnomAD、3个为新；GTEx 600人SV未发现；RE1及侧翼有罕见SNV但不影响保守5′或3′剪接位点。
CADM2内含子缺失的体外模型显示递归剪接被破坏：CRISPR构建het 100 kb del、het/hom 500 bp del、het 500 bp inv。iPSCs和iNs中，RS1缺失或倒位以合子剂量依赖方式消除RS；exon 1至RE1连接qPCR在hom 500 bp del iNs中消失，het中下降44–47%。
CADM2 RS1消融改变内含子上的RNA丰度梯度：wt iNs总RNA-seq在CADM2第一内含子呈“锯齿”模式；RS1删除使第一段斜率变平，第二段在het 500 bp del中轻度变陡，第三段不变；iPSCs类似。
CADM2 RS1缺失降低整体CADM2表达：iNs总RNA-seq显示hom 500 bp del中CADM2表达下降23%，qPCR下降21%，het有轻度下降；iPSCs中hom 500 bp del RNA-seq下降62.5%，qPCR下降59%。
CADM2 RS1缺失降低下游外显子表达：编辑iNs中RE1使用下降，hom 500 bp del中RE1完全缺失；RE1下游高表达外显子3–11在hom中平均下降25%，het平均下降9%；替代外显子和反义转录本无差异。
De novo CADM2转录本重建识别新转录本和注释转录本：结合总RNA-seq和Capture-Seq重建17个转录本；多数类似已知异构体但具新特征，5个涉及全新剪接连接和外显子；一个全长转录本CADM2-201_1'_+RE1+RE2和两个部分转录本包含RE1和/或RE2。
CADM2 RS1缺失影响特定CADM2转录本表达：17个转录本中7个呈基因型依赖变化；CADM2-201_1'_RE1*在hom 500 bp del下降；CADM2-201_1'_RE2*在多种缺失中下降；CADM2_U4下降；exon 1后内含子保留转录本CADM2-201_1'*增加。Capture-Seq显示涉及RE的剪接连接改变，而早期和晚期编码外显子剪接无实质变化。
CADM2 RS1缺失引起以神经元通路为中心的全局转录组效应：hom 500 bp del有1,639个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），het 100 kb del有2,161个，het 500 bp inv有442个，het 500 bp del有259个；DEG集合显著重叠；富集于神经发生、神经元分化、生物黏附、细胞迁移和神经元发育等；部分ADHD相关基因如COMT、FOXP2、SNAP25、ADRA2A在DEG中；人类表型本体（human phenotype ontology, HPO）分析未发现显著基因集。
CADM2 RS1缺失的诱导神经元模型未显示总体电生理或形态学差异：IncuCyte未发现神经突长度/分支点差异；微电极阵列未发现加权平均放电率、爆发频率等显著变化。
啮齿动物Cadm2 RS1缺失模型显示功能性脑连接和运动活动的适度变化：大鼠Cadm2保守存在RS1；CRISPR短322 bp或长85 kb缺失以剂量依赖方式消除RS；长缺失大鼠额叶皮层Cadm2表达和exon 1–2剪接无显著变化；fMRI Network-Based Statistic（NBS）发现hom长缺失较wt连接降低的子网络；开放场中hom长缺失从静止到移动转换减少；体重、甩尾等无差异；progressive ratio breakpoint test（PRBT）中het长缺失断点较低；pre-pulse inhibition（PPI）、Iowa Gambling Task（IGT）等多数无差异；短缺失中hom最大移动变化高于het。结果提示大鼠Cadm2表达对RS1依赖性低于人类。
讨论部分，研究人员讨论RS的目的，认为转录本选择和长内含子剪接保真性曾被提出。该研究表明，在人iPSCs和iNs中删除RS1降低整体CADM2表达并影响转录本代表性。RE1下游所有稳健表达外显子下降而exon 1不下降，提示剪接体将exon 1连接到下一组成型外显子的效率降低，可能因两者距离极远（exon 1到2约767 kb）和/或保留exon 1至RS1段的pre-mRNA动力学不同。数据还显示RE1和RE2可包含在重建转录本中，RE1可剪接至RE2，提示RE1天然5′剪接位点可被使用，即RE1并非总是递归。包含RE1和/或RE2的转录本可能是中间体，也可能是因RE中终止密码子而被nonsense-mediated decay（NMD）降解的完全剪接但非生产性转录本，尚待确定。较大和较小缺失以及倒位效果相似，提示患者/群体等位基因的表型效应可能主要源于RS破坏。RS在人iPSCs和诱导谷氨酸能神经元中均有活性。CADM2位点包含大量与ADHD相关及更广泛精神行为性状的GWAS/PheWAS命中。大鼠模型中行为差异适度且不一致，可能因行为研究效能不足、远交背景等；未来需在人类队列中详细表型刻画并反向转化。研究局限包括RS1缺失罕见、无法深度表型个体；小等位基因小于第一内含子1/1000，除RS位点和RE外不含已知功能序列；未发现隐秘剪接位点激活证据；倒位作为重要比较支持RS消融效应。未来方向包括其他基因中RS变异、其他细胞类型和发育时间点、以及CADM2剪接或表达的实验/治疗调控。
研究结论翻译：该研究证明，RS是与一系列神经精神及行为性状相关基因中的一种非编码调控机制。
