《International Journal of Neonatal Screening》：Dried Urine Spots for Quantification of C0 (Free) Carnitine Excretion: A Validated Method for Follow-Up and Confirmatory Testing of Primary Carnitine Deficiency
编辑推荐：
原发性肉碱缺乏症（primary carnitine deficiency, PCD）由新型有机阳离子转运体2（Organic Cation Transporter Novel 2, OCTN2）缺陷引起，可通过新生儿筛查（newborn screening,
原发性肉碱缺乏症（primary carnitine deficiency, PCD）由新型有机阳离子转运体2（Organic Cation Transporter Novel 2, OCTN2）缺陷引起，可通过新生儿筛查（newborn screening, NBS）检测血液低游离肉碱（free carnitine, C0）浓度发现。确诊可通过证明尿液C0排泄增加来支持，但在新生儿中收集尿液在技术上具有挑战性。研究人员开发并验证了一种干尿斑（dried urine spot, DUS）方法，用于定量尿液C0排泄，作为传统液体尿液采样的实用、非侵入性替代方案。该方法有望让家长在家中通过将滤纸卡置于婴儿皮肤与干尿布之间获取尿液，从而简化样本采集。研究人员通过流动注射分析-串联质谱法（flow injection analysis–tandem mass spectrometry, FIA–MS/MS），在丁酯化后对6 mm DUS打孔片中的C0肉碱和肌酐进行定量。该方法在灵敏度、精密度、稳定性以及与液体尿液测量的一致性方面进行了分析验证。该方法表现出优异的分析性能，C0的检测下限（lower limit of detection, LLOD）/定量下限（lower limit of quantification, LLOQ）值为0.02/0.07 μmol/L，肌酐为0.01/0.04 mmol/L。将C0归一化至肌酐可减少与采样和打孔位置相关的变异性。两种分析物在室温下至少10天以及经过11次冻融循环后在DUS中均保持稳定。从DUS获得的C0/肌酐比值与液体尿液显示出极好的一致性（R2 > 0.9967），尽管浓度始终较低，需应用1.27的校正因子以估算相当于液体尿液的浓度。DUS为测量新生儿C0排泄提供了一种可靠且准确的液体尿液替代方法。这种简单的居家采样方式便于非侵入性尿液采集，并有可能支持PCD的随访和确诊检测。
一、研究背景与目的
原发性肉碱缺乏症（primary carnitine deficiency, PCD）是一种由SLC22A5基因编码的新型有机阳离子转运体2（Organic Cation Transporter Novel 2, OCTN2）功能缺陷引起的常染色体隐性遗传病。OCTN2功能缺陷会损害细胞对肉碱的摄取以及肾小管对肉碱的重吸收，导致血液和组织中游离肉碱（free carnitine, C0）浓度显著降低。在许多国家，PCD被纳入新生儿筛查（newborn screening, NBS）项目，筛查依据是干血斑（dried blood spot, DBS）中测得的低C0浓度。然而，NBS对PCD的阳性预测值（positive predictive value, PPV）仍然相对较低，即使是在第二次DBS标本中确认C0持续偏低后再进行转诊的情况下也是如此。因此，许多未患PCD的新生儿被转诊至代谢中心，增加了医疗成本并给家庭带来情感负担。提高异常NBS结果后随访检测的特异性是一个重要目标。
在生理条件下，超过95%的过滤肉碱会被近端肾小管的OCTN2重吸收。PCD患者由于OCTN2功能缺陷，即使在血浆C0浓度极低的情况下，仍会导致尿液中C0肉碱大量丢失。因此，尿C0排泄增加，特别是结合低血浆C0水平，是PCD的一个特征性生化指标。已有研究表明，尿C0排泄是区分真正PCD与假阳性NBS转诊的有价值生物标志物。尽管尿液检测具有临床实用性，但在新生儿中采集尿液仍然困难，尤其是在医疗机构之外。干尿斑（dried urine spot, DUS）采集在滤纸上提供了一个有吸引力的替代方案。与DBS类似，DUS便于居家采样、普通邮件运输和便捷储存，同时能维持分析物稳定性。此外，尿液采集无痛、非侵入性且不受血细胞比容影响，使其特别适用于新生儿随访检测。本研究的目的是开发和验证一种用于同时定量DUS中C0肉碱和肌酐的方法，重点探索DUS作为NBS筛查算法中互补基质的潜力，特别关注尿液施加、DUS处理、代谢物稳定性以及评估液体尿液与DUS结果之间的一致性。
二、研究方法概述
本研究开发并验证了一种基于流动注射分析-串联质谱法（flow injection analysis–tandem mass spectrometry, FIA–MS/MS）的DUS分析方法。关键方法包括：使用Whatman 903号滤纸制备DUS，采用6 mm直径打孔片（对应约1.9 μL尿液），以甲醇为提取溶剂进行15分钟超声提取，随后进行丁酯化衍生处理，并使用FIA–MS/MS在多反应监测（multiple reaction monitoring, MRM）模式下进行定量分析。方法学验证涵盖了准确性、精密度、选择性、特异性、线性、灵敏度、携带污染、回收率、过程效率及稳定性等指标。研究使用了来自荷兰乌得勒支大学医学中心代谢诊断科的人体尿液样本，并通过ERNDIM（欧洲遗传代谢病筛查、诊断和治疗评估与改进研究网络）提供的专门检测进行了验证分析。
三、主要研究结果
- •
方法开发
- •
丁酯化与非丁酯化比较：C0的丁酯化处理改善了峰形和选择性，并将灵敏度提高了100倍，使得能够从极小样本体积中进行准确定量。为了在同一运行中同时分析两种目标分析物，肌酐也经过了衍生化处理。
- •
6 mm打孔片对应的点样体积：DUS面积与施加尿液体积之间存在线性关系（R2 = 0.9953）。每个6 mm直径的DUS对应约1.9 μL尿液。
- •
提取效率：纯甲醇因其挥发性、与丁酯化反应的兼容性以及高效提取极性和非极性分析物的能力而被选为提取溶剂。15分钟的超声提取可获得一致的结果且变异性最小。
- •
分析物电离：滤纸基质对分析物电离的影响很小，斜率变化仅为0.09%，表明在整个纸质基质中响应一致。
- •
DUS采集与色谱效应：对于点样样本，不同打孔位置的C0浓度一致。而通过浸渍（饱和）法制备的DUS，其C0浓度高于点样样本。将C0浓度归一化至肌酐后，这些差异得以最小化，表明肌酐校正有效补偿了体积和分散相关的变异性。
- •
方法验证
- •
准确性与精密度：在ERNDIM样本中，C0的平均准确性为107.6%。通过外标校准和标准加入法获得的响应系数比较表明基质效应可忽略不计（<5%）。C0和肌酐的批内变异<20%，批间变异<18%。将C0浓度归一化至肌酐后，批内变异低于5%。
- •
选择性与特异性：通过使用稳定的同位素标记内标以及监测定量离子和定性离子的MRM跃迁，确保了检测的准确性和特异性。
- •
线性：C0和肌酐在液体尿液和DUS中均表现出优异的线性（R2均大于0.997）。
- •
灵敏度与携带污染：DUS中C0的检测下限（LLOD）和定量下限（LLOQ）分别为0.02 μmol/L和0.07 μmol/L，肌酐分别为0.01 mmol/L和0.04 mmol/L。未检测到显著的携带污染。
- •
过程效率：DUS中C0的过程效率范围为98.2–107.9%（均值101.4%），肌酐为93.2–112.3%（均值99.2%）。
- •
稳定性：处理后样本在4°C储存28天内最大变异系数（CV）为2.5%（C0）和2.7%（肌酐）。室温下储存10天未见显著变化。在40°C下模拟运输条件7天，C0的最大CV为3.9%。经过11次冻融循环，C0的最大CV为15.6%。
- •
交叉验证：本FIA-MS/MS方法与常规技术（包括Jaffé比色法和已报道的ESI-MS/MS方法）测量的液体尿液C0排泄值高度相关（R2 = 0.9915）。对102对配对的DUS和液体尿液样本的分析显示，两种基质之间存在强相关性。当以μmol/mmol肌酐表示时，DUS中的C0值较低，需要应用1.27的校正因子来估算相当于液体尿液的浓度。经此调整后，Bland-Altman分析显示DUS与液体尿液测量值之间无显著差异（p = 0.37）。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究证实了使用最小样本体积（6 mm打孔片，约1.9 μL）即可在DUS中可靠地定量C0排泄，其结果与液体尿液高度吻合。归一化至肌酐对于校正DUS固有的尿液稀释、点样沉积和施加尿液量的变异性至关重要。滤纸基质能有效稳定两种分析物，支持其在环境温度下长时间储存（至少10天）和高温（40°C，至少7天）下的稳定性，证明了DUS作为新生儿筛查应用采样基质的稳健性。
尽管总体一致，但DUS中的C0排泄值（μmol/mmol肌酐）始终低于液体尿液，需要应用校正因子（1.27）。这种偏差可能源于提取效率的差异以及基于斑点面积的体积校正的不确定性。研究强调，在将DUS测量值转化为临床可解释值时，需要进行基质特异性校准。
在NBS中，DBS中的低C0浓度常由母体肉碱缺乏而非新生儿代谢异常引起。尿C0排泄评估提供了关键的补充信息，有助于区分新生儿的异常肉碱处理与因母体缺乏导致的低肉碱状态。先前的研究已确立了使用尿C0排泄值（约1月龄时截断值为15.2 μmol/mmol肌酐）来区分真正PCD与假阳性转诊。本研究展示的分析性能支持将DUS整合到现有NBS工作流程中，作为一种额外的分析维度。DUS与DBS的结合可以实现系统C0浓度和尿液排泄的平行评估，提供互补的生化信息，从而提高分类性能并减少不确定性。
从实践角度看，DUS具有非侵入性采样、适合居家采集以及无需冷链运输即可保持稳定等优势。在已建立的采用类似方法的尿液筛查项目中，已证明了其人群层面的可行性。
在实施前仍需解决若干局限性，例如本研究使用的是施加到滤纸上的液体尿液而非前瞻性收集的DUS，居家采样可能引入粪便污染和外来物质暴露等变异性，以及DUS缺乏视觉对比度可能需要紫外线引导打孔等问题。
研究结论：DUS为定量C0排泄提供了一个稳健且分析可靠的基质。将其整合到NBS随访策略中，与第二次DBS相结合，可能为支持PCD的诊断评估和优化转诊路径提供一种有前景的方法。
