氦离子全身照射对小鼠行为、记忆、小胶质细胞及血液代谢组的影响

《Biology》：Impact of Helium Ions on Mouse Behavior, Memory, Microglia, and Blood Metabolome

　　

长期太空任务和氦离子（⁴He）放疗要求评估其对中枢神经系统（CNS）的后果。本研究探讨了2 Gy氦离子全身照射对雄性Balb/c小鼠大脑的影响，重点关注认知功能、小胶质细胞状态、基因表达和全身代谢。未检测到海马依赖性行为或空间记忆的统计学显著缺陷。然而，检测到细胞和分子水平的改变。在多个照射后时间点观察到Iba1阳性细胞密度降低，并伴随形态向分支减少的状态转变。基因表达分析揭示出复杂的反应，包括混合的神经免疫激活谱、氧化还原相关基因表达的改变以及关键防御基因的下调。代谢组学鉴定出19种血浆代谢物的变化，与能量和氨基酸代谢的改变一致。尽管2 Gy在早期延迟期未表现为明显的认知损伤，但8周时可检测到分子和细胞改变，包括多个照射后时间点的Iba1阳性细胞密度降低、小胶质细胞形态改变、神经免疫和氧化还原相关基因表达改变以及全身代谢变化。这些发现强调了在氦离子暴露实验模型中超越行为测试的多模式评估的重要性。由于本研究所用暴露条件既不同于慢性混合场银河宇宙射线（GCR）环境，也不同于局部临床氦离子放疗，结果应被视为基础放射性物学观察，而非对太空飞行或放疗结局的直接预测。

长期太空飞行和氦离子（⁴He）放疗的应用促使研究人员必须评估氦离子对中枢神经系统（CNS）的后果。氦离子是银河宇宙射线（GCR）的重要组分，也是介于质子和碳离子束之间的粒子治疗候选。然而，目前针对氦离子对CNS功能影响的研究仍很少。已有研究多针对质子、铁、硅、钛、氧等粒子，且不少采用头部局部照射，而深空任务中宇航员实际受到的是全身暴露。神经元是终末分化细胞，无法通过增殖清除受损细胞，因此对累积性辐射损伤尤其脆弱。本研究采用2 Gy氦离子全身照射雄性Balb/c小鼠，从认知功能、小胶质细胞状态、基因表达和全身代谢多个层面评估照射后早期延迟期效应。该剂量明显超过深空任务中氦离子的预期贡献，相当于肿瘤放疗中的常规分次剂量，但作为单次急性全身照射，既不直接模拟慢性低剂量率混合GCR环境，也不等同于临床氦离子治疗中高度局部的计划照射，因此被视为一种实验性放射生物学模型。

研究人员使用雄性Balb/c小鼠（n=40，8周龄，来自俄罗斯Stolbovaya breeding station，饲养于俄罗斯科学院理论与实验生物物理研究所（ITEB RAS），Pushchino），在俄罗斯Protvino的Prometheus装置（JSC“Protom”）接受320 MeV（80 MeV/nucleon）氦离子全身照射，剂量2 Gy，线性能量转移（LET）约3.4 keV/μm。照射后5–7周进行旷场（OF）、高架十字迷宫（EPM）、明暗箱（LDB）和巴恩斯迷宫行为学测试。小胶质细胞通过Iba-1免疫组化染色，在照射后1天、1周、1个月和2个月（8周）取样，采用线性混合效应模型分析密度与形态参数（每组n=3–5）。8周后脑组织用实时定量PCR（qPCR）检测12种基因表达（每组n=3）；血浆用¹H NMR谱结合主成分分析（PCA）和组平均差谱法分析代谢物（每组n=5）。所有统计均以动物为生物学单位，避免将细胞或切片作为独立重复。

**3.1 行为结果**
**3.1.1 旷场测试（OF）**：照射后7周，小鼠运动距离、平均速度、中心区停留时间与进入频率、理毛、冻结、站立等指标与对照组均无统计学差异，排便和排尿次数接近，提示在本次实验条件下未检测到显著的焦虑样或情绪状态改变。
**3.1.2 巴恩斯迷宫**：两组小鼠在10次训练中逃避潜伏期均随训练次数显著下降（p=0.001），但组间差异（p=0.369）和组×训练交互作用（p=0.862）均不显著；学习后第3天和第9天的长期记忆测试中，两组完成任务的动物比例相同（各50%），无显著差异。值得注意的是，大量观察值达到180秒的最大允许潜伏期，降低了检测细微学习差异的灵敏度。
**3.1.3 高架十字迷宫（EPM）**：两组在总运动距离、速度、开放臂停留时间、封闭臂进入次数及首次进入封闭臂潜伏期方面均无显著差异，提示2 Gy氦离子照射未引起可检测的焦虑相关行为改变。
**3.1.4 明暗箱测试（LDB）**：运动活性、明暗箱停留时间及探头次数在两组间均无显著差异，进一步支持未出现明显行为表型改变。
因此，行为学检测未发现2 Gy氦离子全身照射导致可察觉的认知或情感缺陷。

**3.2 小胶质细胞**
研究人员共分析569张脑片和56,785个小胶质细胞。与合并对照组相比，Iba-1阳性细胞密度在照射后1天（估计差为?397.34 cells/mm²，调整后p=0.004）、1个月（?451.39 cells/mm²，p=0.003）和2个月（?397.05 cells/mm²，p=0.007）显著降低，1周时虽有降低但未达统计显著（?105.84 cells/mm²，p=0.377）。形态参数方面，仅2个月组的圆度显著增加（估计0.050，p=0.046），1天和2个月组的实心度显著增加（分别0.056，p=0.004和0.076，p<0.001）；细胞面积、周长、长宽比和圆度等其余指标多数无显著组间差异。结果表明，照射后小胶质细胞数量减少比形态改变更为稳健。

**3.3 基因表达分析**
照射后8周脑组织qPCR结果显示，与对照组相比，CCL2、CD206和SOD2表达显著上调；TLR4、CX3CR1、CAT、ATM和BCL2表达显著下调；CD163呈下降趋势但未见显著。这些变化提示脑内存在持续的神经免疫信号激活、非典型或混合型髓系活化谱、氧化还原平衡改变，以及DNA损伤修复和抗凋亡防御信号减弱。

**3.4 NMR代谢组学结果**
血浆¹H NMR谱的PCA三维得分图显示对照组和照射组部分重叠，未见清晰分离，且未进行正式多元统计检验。基于组平均谱的差谱分析共鉴定出19种代谢物的相对水平改变，其中琥珀酸、肌酸、甜菜碱、三甲胺和延胡索酸趋于升高；牛磺酸、酪氨酸、异丁酸和丙酮酸趋于降低。由于该分析采用组平均谱且未进行多重比较校正，这些变化应视为探索性趋势。同时，全身照射后血浆代谢物可能来源于多个照射组织，不能单独归因于脑。

**讨论与结论**
讨论强调，本研究的2 Gy急性全身照射既不同于深空任务中的慢性低剂量率混合GCR环境，也不同于临床氦离子治疗的局部计划照射；行为学无显著差异不能证明无效应，样本量和180秒上限降低了检验灵敏度。小胶质细胞密度降低是较稳定的后果，但尚不能判定其是否为功能障碍；基因表达改变提示脑内存在持续的、部分代偿性的神经免疫和氧化还原信号变化；血浆代谢组变化则反映多种组织的协同反应。研究结论可概括为：2 Gy氦离子照射后8周未产生明显的神经行为或认知缺陷，但可检测到分子、细胞和全身代谢改变，包括小胶质细胞密度降低、形态改变，神经免疫、氧化还原及DNA修复相关基因表达改变，以及独特的血浆代谢组谱。由于这些变化出现在没有明显行为缺陷的情况下，研究人员假设这些早期分子和细胞改变可能在更晚时间点或联合应激下易导致功能缺陷，但这有待长期研究验证。这些发现强调了在带电粒子暴露效应评估中，除行为测试外采用多模态评估的重要性，并说明未来研究需要延长随访时间。