急性体内邻近标记技术解析神经环路膜靶向蛋白质组

《Cell Reports Methods》：Acute in vivo proximity labeling for membrane-targeted proteomics in neuronal circuits

　　

： 分子系统神经科学的一个主要目标是桥接神经环路功能研究与清醒行为动物中蛋白质表达和定位变化之间的联系。然而，目前可用于在体内（in vivo）活动门控时间尺度上捕获神经环路内亚细胞定位蛋白质组变化的工具十分有限。在此，研究人员设计了邻近标记酶TurboID的膜靶向版本，以在用户递送生物素注射期间标记神经元膜上的蛋白质。研究人员优化了一种标记策略，可实现1至2小时的标记窗口，并标记了内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC）细胞体及其下游投射区域相应轴突中的蛋白质。研究人员进行了蛋白质组学分析，以鉴定mPFC细胞体和神经末梢中富集的蛋白质，以及急性可卡因注射后mPFC细胞体中上调的蛋白质。这些进展使得能够在短标记窗口内检测亚细胞水平的蛋白质，从而能够在行为小鼠中鉴定刺激特异性蛋白质组。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

膜蛋白在神经元信号传导和可塑性中发挥关键作用，对功能神经环路内神经元通讯的调控具有重要贡献。在活体大脑中鉴定特定细胞类型在膜上及膜附近的蛋白质，并在特定时间点进行检测，可能对深入理解神经环路功能背后的细胞过程和机制至关重要。虽然蛋白质亲和纯化技术如亲和下拉和免疫共沉淀仍是鉴定特定靶标蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions, PPIs）和蛋白质复合物的金标准，但这些方法难以在活体大脑中广泛应用。

近年来，研究人员利用邻近标记（proximity labeling, PL）技术的最新进展，通过基因编码和可靶向的酶来标记和富集蛋白质。基于生物素化的邻近标记主要依赖两类工程酶：生物素连接酶和过氧化物酶。过氧化物酶如APEX、APEX2、APEX3和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）可在过氧化氢（H₂O₂）存在下催化生物素-酚的氧化，产生短寿命的生物素-苯氧基自由基。然而，过氧化物酶体内应用受限于H₂O₂的潜在细胞毒性，需在离体（ex vivo）条件下进行标记。相比之下，工程化生物素连接酶BioID和TurboID可在无H₂O₂条件下利用ATP和生物素催化形成反应性生物素-5′-AMP，实现活细胞中的空间精确蛋白质组学定位。然而，此前的研究均需通过多次腹腔注射进行多天的生物素诱导，这一多天标记需求阻碍了捕捉体内特定事件引发的膜相关蛋白急性变化的能力。

二、研究内容与主要结论

为解决上述问题，研究人员开发了膜靶向的TurboID变体，并验证了其在体内（in vivo）急性时间尺度上进行亚细胞定位蛋白质组学分析的可行性。研究结果表明，膜靶向TurboID可在1至2小时的短标记窗口内有效标记蛋白质，能够区分神经元细胞体和轴突末端的蛋白质组，并可检测急性可卡因注射后mPFC神经元膜相关蛋白质组的变化。该研究为在清醒行为小鼠中鉴定刺激特异性蛋白质组提供了新的技术平台。

三、关键技术方法

研究人员构建了多种膜靶向TurboID变体，包括Nrxn-TurboID、Nrxn-CIBN-TurboID、CD4-CIBN-TurboID、TurboID-CAAX1和TurboID-CAAX2，通过不同膜靶向基序将TurboID锚定至神经元膜。在培养神经元中验证了各变体的膜定位和生物素化能力后，选用Nrxn-TurboID和TurboID-CAAX2进行体内实验。实验采用AAV2/1-Synapsin载体在C57BL/6J雄性小鼠mPFC中表达膜靶向TurboID，通过两次间隔1小时的腹腔生物素注射实现急性标记，随后进行组织显微切割、链霉亲和素磁珠富集、胰蛋白酶酶解和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。研究还结合了ROC曲线分析、基因本体（gene ontology, GO）富集分析、STRING网络分析和SynGO突触功能分析等生物信息学方法。

四、研究结果

设计并验证膜-TurboID变体：研究人员生成了多种膜靶向TurboID候选构建体，通过不同膜靶向基序将酶锚定至神经元膜。培养神经元荧光成像证实所有变体均表现出强烈的生物素依赖性蛋白标记，其中Nrxn-TurboID和TurboID-CAAX2表现出清晰的膜定位特征，被选用于体内实验。

体内快速邻近标记：在mPFC中表达Nrxn-TurboID或TurboID-CAAX后，给予两次间隔1小时的腹腔生物素注射，2小时标记窗口即可在细胞体检测到显著高于阴性对照的蛋白标记水平，证实膜靶向TurboID可在数小时而非数天内实现体内急性邻近标记。

mPFC神经元膜相关蛋白质组学分析：通过链霉亲和素磁珠富集和DIA蛋白质组学分析，在Nrxn-TurboID数据集中鉴定出1,881个候选蛋白。将候选蛋白与Allen ABC Atlas单细胞RNA测序数据比对，发现神经元细胞类型具有更高的蛋白质组评分。ROC曲线分析确定了FDR<0.1的L2FC阈值，最终获得280个mPFC膜候选蛋白，GO富集分析显示这些蛋白富集于细胞连接、突触、细胞突起和神经元突起等膜相关细胞组分。

TurboID-CAAX变体蛋白质组学比较：TurboID-CAAX数据集检测到508个候选蛋白，与Nrxn-TurboID数据集共享423个蛋白。比较分析表明，Nrxn-TurboID具有更高的灵敏度和更多的蛋白检出量，而TurboID-CAAX在匹配蛋白质组大小时对真阳性蛋白具有更高的特异性，两者在不同实验场景下具有互补优势。

mPFC长程轴突末端亚细胞靶向蛋白质组学：在mPFC表达Nrxn-TurboID后，可在伏隔核（nucleus accumbens, NAc）的mPFC轴突末端检测到显著生物素化信号。蛋白质组学分析经ROC分析后获得551个突触前膜蛋白候选，GO富集分析显示这些蛋白与膜和突触相关。在更远端的中脑导水管周围灰质（periaqueductal gray, PAG）投射中，因末端数量较少，仅获得143个探索性候选蛋白。将不同投射的独有蛋白与已发表的RNA测序数据比较，发现蛋白质水平与RNA水平的投射特异性高度一致。

药物诱导的mPFC膜相关蛋白质组变化检测：在急性可卡因注射后仅1小时的标记窗口内，研究人员鉴定出106个在mPFC神经元膜显著上调的蛋白。GO富集分析和STRING网络分析显示这些蛋白参与细胞组织与定位、突触信号传导等过程。SynGO分析进一步表明这些蛋白涉及突触前囊泡内吞和外排、化学突触传递调节、突触结构组装与成熟、突触后神经递质受体的定位与内吞等突触功能。

五、讨论与结论

研究人员开发的膜靶向TurboID变体为体内亚细胞靶向神经元蛋白质组学和药物门控蛋白质组学提供了新工具。Nrxn-TurboID和TurboID-CAAX两种变体通过不同机制靶向膜，具有互补优势：Nrxn-TurboID在小隔室中最大化总蛋白检出量，TurboID-CAAX则最大化膜特异性。1至2小时的短标记窗口显著缩短了传统多天标记所需的时间，减少了外源生物素对小鼠大脑和身体的暴露。Nrxn-TurboID在NAc轴突末端的功能验证表明其灵敏度足以用于长程投射的蛋白质组学分析，尽管对于更稀疏的投射可能需要合并生物学样本。

研究还证明了Nrxn-TurboID能够捕捉急性药物诱导的蛋白质组变化，在可卡因注射后1小时内捕获约106个mPFC神经元细胞膜相关蛋白，其中许多可映射至SynGO数据库的突触活动相关生物学过程。该研究为在特定亚细胞位置测定刺激诱导的蛋白质水平变化提供了概念验证。

研究存在以下局限性：过氧化物酶如APEX2仍是分钟级标记的最快选择；病毒介导的TurboID过表达需要仔细的成像和蛋白质验证；病毒表达差异可能掩盖实验条件间的细微蛋白质水平变化；候选蛋白代表膜附近亚细胞区域的蛋白，而非与内源性neurexin的真实蛋白相互作用伙伴；研究仅在雄性小鼠中进行；使用神经元特异性启动子无法区分不同mPFC细胞类型。未来研究可利用增强子或转基因系AAV靶向方法，鉴定特定基因和解剖定义的细胞类型中的膜蛋白，为治疗神经精神和神经疾病提供更准确的药物靶点。