HyHEL10谱系抗体通过CDRH1环去稳定化捕获柔性抗原：物理与AI驱动方法对熵缓冲构象选择的基准评估

《mAbs》：Catching enhanced flexibility in antibody-antigen recognition: critical evaluation of physics-based and AI-driven methods

　　

蛋白质构象动力学常决定蛋白质-蛋白质相互作用机制与功能，因为柔性使其能够适应不同环境。然而，当前基于物理的方法和新兴的人工智能（AI）驱动方法在多大程度上能够预测柔性依赖的物理化学性质，仍有待确定。在此，研究人员研究了HyHEL10（Hy10）抗体谱系与具有不同构象柔性的溶菌酶的结合。与传统模型相反，亲和力成熟的Hy10^4X（Hy104X）抗体通过主动去稳定其重链互补决定区H1（CDRH1）环实现高亲和力，从而通过熵缓冲构象选择（entropy-buffered conformational selection）捕获可移动的抗原变体。这种结构可塑性对标准计算方案构成重大挑战。研究人员发现，极化效应随蛋白质柔性增加而增强。研究人员对分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）和AI驱动结构预测器（structure predictors）的基准评估表明，两种方法最初均无法准确排序更柔性系统中的亲和力，主要由于采样限制和结构预测不准确。然而，在Chai-1中引入结构模板（structural templates）有效缓解了这些限制，从而增强了与实验亲和力的相关性。未来，通过将AI的快速筛选与稳健的基于物理的评估耦合，研究人员可能获得针对蛋白质组中最难捉摸、形状多变的靶点进行治疗性抗体计算机模拟工程（in silico engineering）的潜在途径。关键词：结合自由能（binding free energy）|自由能扰动（FEP）|分子力学广义Born表面积（MMGBSA）|分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MMPBSA）|结构预测（structure prediction）

研究背景：蛋白质构象动力学常决定蛋白质功能及蛋白质-蛋白质相互作用机制。抗体-抗原识别是蛋白质-蛋白质相互作用的特殊类别，其精确分子识别支撑适应性免疫和治疗性抗体开发。传统“锁钥”模型认为，亲和力成熟通过结构刚性化实现，即体细胞超突变预组织互补决定区（Complementarity-Determining Regions, CDRs），降低结合熵罚并优化焓相互作用。然而，对具有多构象、内在无序或高度柔性抗原，该模型面临悖论；越来越多证据提示“熵性互补位”（entropic paratope）等替代策略。HyHEL10（Hy10）抗体谱系是研究自然优化抗原识别的例子：野生型Hy10对“刚性”溶菌酶抗原高亲和，但对“Flex”变体亲和力下降两个数量级；Flex抗原因Cys76Ser和Cys94Ser突变破坏Cys76–Cys94二硫键而稳定性下降。生发中心选择产生克隆救赎的Hy10^4X变体（L4F、Y33H、S56N和Y58F），对Flex抗原亲和力较野生型提高100倍，并增强外源与自身抗原区分。计算预测这些动态和变构效应仍具挑战；深度学习结合亲和力预测存在泛化、长程效应和多突变捕捉限制；结构预测工具虽能全局折叠，但动态界面局部精细位移未证；物理方法如MM/GBSA、MM/PBSA、自由能扰动（FEP）依赖分子动力学（MD）采样，对结合伴随大构象重排的系统困难。因此，研究人员开展本研究。

关键技术方法概括：研究人员使用PDB条目6P4A、6P4B、6P4C、6P4D及5AYU作为结构来源，构建未结合抗体、未结合抗原和抗体-抗原复合物体系。采用Amber20与CHARMM36m全原子力场进行微秒级MD模拟，使用TIP3P水、0.15 M NaCl、PME长程静电；进行均方根涨落（RMSF）、均方根偏差（RMSD）、主成分分析（PCA）、自由能景观（FEL）、二面角熵、转移熵、准简谐分析（QHA）和动态互相关分析。结合自由能用MM/GBSA（GBSW、GBMV）和MM/PBSA（SurfPB）计算；相对结合自由能用FEP（NAMD双拓扑、BAR）。AI结构预测与置信度使用Protenix、Deepconformer、ESMFold2、AlphaFold 3和Chai-1；Chai-1使用6P4B模板和距离约束。

研究结果：

1. 柔性构象景观使Hy10^4X突变体提供比野生型Hy10^WT抗体更广的选择池。通过晶体结构比较、MD、RMSF、PCA和FEL，发现CDRH1是主要差异区域；未结合Hy10^4X晶体中T25–D27受晶格氯离子配位，MD中快速偏离，而S28–T30的3₁₀螺旋持久；结合态Hy10^4X的CDRH1柔性显著高于结合态Hy10^WT；PCA显示Hy10^WT局限于右下区域，Hy10^4X结合态采样更广；自由能景观显示结合与未结合态间存在能垒，跨越后突变体具有更灵活景观；六个局部极小对应不同CDRH1构象，其中簇4结合柔性溶菌酶，簇6结合野生型抗原；突变体构象空间覆盖野生型构象，说明CDRH1更柔性，可适应更柔抗原，解释其对柔性抗原更高亲和。层次聚类识别出两个主要簇，分别占23.8%和21.6%。

2. 互补位-表位相互适应柔性驱动高度移动抗原识别。通过模拟刚性和Flex溶菌酶变体，发现Flex整体涨落更高，60–80区域RMSF显著升高，峰值约4.5 ?；晶体B因子在复合物中60–80区域反而高于单体，MD确认复合物中60–80区域RMSF高于apo，表明结合后熵增；抗体侧结合衍生apo Hy10^4X的CDRH1 RMSF高于复合物；转移熵显示柔性抗原从抗体获得更多熵；构象熵计算显示刚性抗原结合获18.36 kcal/mol，Flex获20.52 kcal/mol，Hy10^WT和Hy10^4X分别损失19.67和19.91 kcal/mol。结论为：非经典适应识别机制，突变破坏CDRH1的3₁₀螺旋作为结构开关，释放构象熵池；成熟抗体作为熵供体，建立高度耦合界面，实现高亲和而不牺牲结构可塑性。

3. 基于物理的Ag-Ab结合能评估中的构象采样与极化。研究人员用MM/GBSA和MM/PBSA评估一系列突变抗体与Rigid、Flex、Hel3x抗原的结合能。基于Hy10^WT-抗原复合物MD生成突变体（L4F、I29F、S31N、Y33H、S52T、Y53F、S56N、S56R、S56Y、Y58F）。GBSW总体r=-0.14，Flex r=-0.56；GBMV analytical II总体0.23，Flex -0.36，Rigid 0.44，HEL3x 0.30；GBMV grid总体0.30，Rigid 0.59，HEL3x 0.50，Rigid+HEL3x 0.79，但Flex差，未结合构象低估，结合构象r=0.41但高估。MM/PBSA总体0.81，Rigid和HEL3x约0.71，Flex未结合r=-0.14，结合r=0.36；表明更好极化计算恢复Flex变构效应，柔性系统更敏感于极化。FEP对单点突变ΔΔG，平均绝对误差0.75 kcal/mol，Flex和Rigid r=0.4，Hel3x排除I29F后r=0.64；I29F误差大，AlphaFold 3预测其破坏局部螺旋，但采样不足。MM/PBSA同数据集Flex r=0.283，Rigid 0.885，Hel3x 0.870。FEP正确预测Flex结合亲和变化，受益于增强动力学，但采样质量突变和系统依赖，部分未完全收敛。结论：端点方法对刚性系统可靠，对柔性系统因构象熵采样和极化处理不足；FEP受采样瓶颈。

4. AI预测的结构置信度与亲和力相关。序列模型digiwiser预测ΔΔG，Flex r=-0.19，Rigid 0.62，HEL3x 0.49，说明需结构和动力学。用Protenix和Deepconformer各生成40结构，界面预测TM-score（ipTM）与实验亲和力负相关，总体Protenix r=-0.61，Deepconformer r=-0.57；Rigid和Hel3x强，Flex弱（Protenix r=-0.10）。gPDE类似。可视化显示Protenix将突变CDRH1预测成接近野生型，未捕捉Flex抗原二硫键丢失导致的位移；ESMFold2也类似，Flex r=0.23。AlphaFold 3无界面约束常产生错误结合模式，ipTM/ipSAE不一致。Chai-1使用6P4B模板和距离约束，打破野生型结构陷阱，采样更广CDRH1构象，Flex ipTM与实验亲和力相关性改善至-0.59。增加Protenix预测至100结构均值ipTM和相关性几乎不变。模板引导改善结构预测模型对界面差异敏感性。结论：AI置信度可作结合能量代理，但需正确结构模板；结构ensemble非玻尔兹曼热力学ensemble。

讨论总结：讨论部分强调亲和力成熟不限于刚性预组织；Hy10^4X突变重塑并拓宽CDRH1构象集合，减少自身识别同时捕获柔性外源抗原，即“进化柔性”；提出“熵缓冲构象选择”，抗体向抗原60–80环定向熵流作为热力学汇，抵消结合熵成本，维持高度耦合复合物。与GD2抗体3F8和ch14.18等平行；Solieva et al.模拟显示亲和力成熟不一定统一刚性化。物理方法MM/PBSA/MM/GBSA敏感于力场、电荷、溶剂、采样和构象熵；未包含构型熵，应视为有效相对结合能；隐式溶剂不描述界面水重排，固定电荷力场忽略电子极化。Rigid和Hel3x相关性好，Flex差。MM/PBSA比MM/GBSA更好恢复Flex趋势。与Tandiana et al.基准比较。AI置信度可高通量筛选但非直接能量分数；Chai-1模板整合缓解采样瓶颈；置信头可重解释为能量模型。结构ensemble非热力学ensemble；增加预测数不能补偿动态异质结合景观。FEP窗口短、收敛不均，应视为近似比较估计；远端突变位点误差大，常规FEP对非局部重排有偏；需增强采样或包含突变结构后果的起始ensemble。混合协议如MDR-FEP有前景。方法选择需权衡计算成本与物理严谨性：快速评分初筛，MM/GB(PB)SA精修，FEP最终评估优先突变。

结论翻译：总之，该研究表明抗体可进化出柔性以识别动态抗原。这种“熵性互补位”（entropic paratope）策略暴露了当前基于物理和人工智能（AI）驱动的自由能方法在解析变构（allosteric）和熵效应时的关键采样限制。未来，通过将AI快速筛选与稳健的基于物理的评估耦合，研究人员可能获得针对蛋白质组中最难捉摸、形状多变靶点进行治疗性抗体计算机模拟工程（in silico engineering）的潜在途径。