《Horticulturae》：Vegetable Haploid Induction Technology: From Traditional Methods to Broad-Spectrum Induction via Gene Editing
纯合系的获得是蔬菜作物育种和种质改良中的关键步骤。传统的自交纯化方法耗时长，且易导致严重的近交衰退。相比之下，单倍体育种技术能够通过染色体加倍，在一至两个世代内快速获得完全纯合的双单倍体（doubled haploid, DH）系，是大幅缩短育种周期、提升育种效率的革命性途径。本综述系统梳理了植物单倍体诱导技术的主要演进里程碑，追溯了其从自然发生、离体调控到现代活体精准遗传操作的发展历程。重点讨论了通过雌雄配子体培养（gynogenesis）、雄核发育（androgenesis）、远缘杂交，以及近年来利用CRISPR/Cas9等基因编辑工具对关键生殖基因（如CENH3、MTL/PLA1/NLD和DMP）进行定向敲除或修饰来构建活体单倍体诱导系的主要技术路径。此外，本文探讨了五种主要单倍体鉴定技术的优缺点及应用场景，包括形态学评价、气孔保卫细胞观察、细胞遗传学分析（染色体压片法和流式细胞术）、分子标记以及遗传标记（包括经典花青素系统、高油系统和新型荧光蛋白报告系统）。文中还详述了十字花科（Brassicaceae）、茄科（Solanaceae）和葫芦科（Cucurbitaceae）主要蔬菜作物单倍体诱导的最新研究进展，并分析了当前存在的强基因型依赖性和低胚-苗转化率等技术瓶颈。最后，展望了通用基因编辑诱导技术与高通量荧光蛋白分选系统深度融合的未来发展趋势。本综述旨在为建立大规模、高效率的蔬菜作物一体化单倍体育种体系提供系统的理论框架和技术参考。
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引言
纯合系的获得是蔬菜育种和种质改良的基石。纯合自交系不仅是组装优良杂交组合以利用杂种优势的重要亲本材料，也是精细基因定位、功能基因组学和标记辅助选择（marker-assisted selection, MAS）的理想遗传资源。传统上，纯合系的创制高度依赖亲本材料的连续自交，通过多代遗传分离和人工选择推动杂合位点趋于纯合。然而，传统自交是一个漫长且低效的过程，通常需要连续自交六至八个世代才能获得遗传稳定的自交系。该方法还耗费土地和劳力。此外，纯化过程中近交衰退的程度在不同蔬菜作物间差异显著，并强烈受其繁殖系统和遗传背景影响。在高度杂合或异花授粉为主的物种中，反复自交可能导致活力、生长性能和胁迫耐受性的大幅下降，使得优良种质的维持尤为困难。因此，加速纯合系的创制仍是蔬菜育种计划的主要目标。
单倍体育种技术为克服这些瓶颈提供了高效途径。该技术人工诱导作物产生仅含母本或父本基因组的单倍体植株，随后通过自发或人工诱导的染色体加倍，可在一至两个世代内快速获得完全纯合的双单倍体系，从而大幅加速育种周期。目前，单倍体诱导技术已在玉米（Zea mays）、小麦（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）和番茄（Solanum lycopersicum）等主要作物中广泛应用。本综述系统总结了植物单倍体诱导的主要途径和倍性鉴定方法，重点关注十字花科、茄科和葫芦科重要蔬菜作物单倍体育种的研究进展和当前应用现状，并剖析了当前限制该领域的技术瓶颈，展望了未来发展趋势，旨在为建立高效一体化的蔬菜作物单倍体育种体系提供理论框架和技术参考。
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单倍体诱导的历史里程碑
从技术演进的角度，单倍体植株的发现和诱导策略的发展可大致划分为三个阶段：早期自发单倍体发生的观察、离体微环境调控系统的建立，以及现代活体精准遗传操作方法的兴起。1922年，Blakeslee等人首次在曼陀罗（Datura stramonium）中发现了自然发生的单倍体。然而，自然界中单倍体出现的概率极低，无法满足育种需求。人工单倍体诱导的重大突破发生在20世纪60年代。1964年，Guha等人通过离体花药培养成功诱导曼陀罗产生单倍体植株，证明了雄性配子体细胞的胚胎发生潜能，开创了植物雄核发育研究。此后，Nitsch等人利用该技术在烟草（Nicotiana tabacum）中建立了高效单倍体再生体系。自此，单倍体诱导技术进入快速发展阶段，诱导方法从最初的花药培养扩展到游离小孢子培养、未受精胚珠/子房培养、远缘杂交以及基因编辑介导的诱导。迄今为止，全球已有超过200种植物报道了单倍体诱导，但其效率和适用性高度依赖物种、基因型和品系特性，与遗传背景和表观遗传调控密切相关。在蔬菜作物领域，番茄、白菜（Brassica rapa）、黄瓜（Cucumis sativus）和西瓜（Citrullus lanatus）等核心物种的单倍体诱导技术已逐步成熟，为大幅缩短育种周期、提升园艺作物育种效率提供了关键技术支撑。
根据诱导过程中配子体或合子发育的物理微环境，人工单倍体诱导分为两大类：离体诱导和活体诱导。离体诱导主要依赖组织培养技术，通过人工控制培养条件，使配子体偏离正常配子体发育途径，转向孢子体细胞分裂。该类包括基于雄核发育的花药和游离小孢子培养，以及基于雌核发育的未受精胚珠、子房和胚囊培养。相比之下，活体诱导发生在完整植物有机体内，主要包括远缘杂交、辐照花粉授粉、利用天然单倍体诱导系，以及应用CRISPR/Cas9介导的基因编辑构建特定单倍体诱导系（如靶向CENH3、DMP和MATL等位点）。
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单倍体诱导的主要技术
单倍体诱导技术大致可分为传统的离体方法和新兴的活体诱导系统。传统方法主要依赖雌核发育和雄核发育分别对雌性或雄性配子体细胞进行重编程，而近期进展包括远缘杂交介导的染色体消除和基于基因编辑的单倍体诱导系。
3.1. 雌核发育
雌核发育是指利用离体培养诱导未受精胚囊、胚珠或子房偏离正常发育途径，直接分裂形成单倍体胚或愈伤组织，进而再生植株的技术。自大麦中首次报道雌核发育以来，该技术已在多种作物中展现出巨大的育种潜力。在蔬菜作物中，洋葱（Allium cepa）、甜菜（Beta vulgaris）和甜瓜（Cucumis melo）等物种已建立并完善了稳健的雌核发育体系。大量研究表明，优化培养基组分、改善供体植株的环境条件以及简化实验流程可显著提高雌核发育诱导频率。例如，在甜菜中，外源施用多胺可显著提高诱导率。此外，在葫芦科作物中，在培养基中补充适宜浓度的细胞分裂素或类细胞分裂素化合物（如噻苯隆，thidiazuron, TDZ）已被证明有利于黄瓜、甜瓜和西瓜的离体雌核发育。
值得注意的是，雌核发育诱导效率表现出强烈的供体基因型依赖性，这可能归因于遗传背景、表观基因组组织以及雌配子体细胞胚胎发生重编程能力的差异。Bohanec和Jak?e对39个洋葱品种的比较研究揭示了不同基因型间胚胎发生效率的巨大差异：部分材料高度顽固，未能产生任何胚，而响应最佳的基因型胚诱导频率可达18.6%至22.6%。这一现象在南瓜（Cucurbita moschata）和黄瓜中也有充分记载。Shalaby通过离体培养12个南瓜品种的未授粉子房，鉴定出优良基因型'Raad F1'，其胚胎发生率达48.4%，每个培养皿平均产生15株幼苗。同样，Liu等人在黄瓜中证明，虽然所有七个测试品种均可诱导形成胚状体，但胚胎发生频率在0.7%至25.3%之间剧烈波动。
这些发现进一步表明，供体基因型是决定雌核发育效率的重要因素；然而，雌核发育诱导的成功受多种相互作用因素调控，包括供体植株发育阶段、生理状态、培养条件和表观遗传调控，这些因素共同影响雌配子体细胞的胚胎发生能力。
3.2. 雄核发育
雄核发育是指通过离体培养诱导花药或游离小孢子等雄性配子体发育成单倍体植株的过程。迄今为止，已在超过250种植物中成功建立了雄核发育诱导系统，包括十字花科、茄科和禾本科成员。尽管该技术相较于雌核发育具有明显优势——如初始外植体供应充足、实验操作简化、适用性更广——但其诱导效率仍受到严格的基因型依赖性和物种特异性的紧密制约。供体植株的遗传背景是驱动离体雄核发育反应的首要决定因素。不仅物种间雄核发育能力存在根本差异，同一物种内不同品种间的诱导效率也差异显著；事实上，某些基因型对雄核发育途径表现出完全顽固性。在黄瓜研究中，Xie等人观察到即使在相同发育阶段取样，不同品种间的花药诱导频率和后续再生表现也存在显著差异。同样，Chanana对芥菜的研究进一步证实，供体基因型不仅是决定小孢子雄核发育反应性的关键因素，也是DH育种计划成功的首要前提。
除基因型外，培养基添加剂对雄核发育成功率影响重大。培养介质化学微环境的精确调控是激活雄核发育脱分化和再分化的必要外源触发因素，其中碳源浓度和植物生长调节剂（plant growth regulator, PGR）比例起核心作用。在芸苔属蔬菜的游离小孢子培养中，13%蔗糖浓度被广泛采用作为维持渗透压和供能的经典标准。然而，越来越多的证据表明，根据特定培养阶段动态调整蔗糖浓度可进一步提高某些基因型材料的胚胎发生。在激素调控及内源与外源激素动态平衡维持方面，生长素和细胞分裂素的协同作用贯穿从胚状体诱导到植株再生的整个雄核发育过程。例如，在辣椒（Capsicum annuum）花药培养中，Mythili等人发现较低浓度的萘乙酸（naphthaleneacetic acid, NAA）有利于胚状体诱导，而较高浓度的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D）则促进愈伤组织形成。对菜心（Brassica campestris）的研究也证实，精确的激素组合，如0.05 mg L-1 6-苄氨基嘌呤（6-benzylaminopurine, 6-BA）加0.5 mg L-1萘乙酸（NAA），可协同提高胚胎发生速率。细胞分裂素和生长素的有益效应主要归因于它们在小孢子发育过程中促进细胞分裂、脱分化和胚胎发生能力获得方面的互补作用。此外，其他调控化合物已被证明可通过不同机制增强雄核发育。参与胁迫信号传导的激素调节因子，包括脱落酸（abscisic acid, ABA）、茉莉酸（jasmonic acid, JA）和水杨酸（salicylic acid, SA），以及抗坏血酸等抗氧化剂，可调节细胞应激反应并在小孢子重编程过程中维持氧化还原稳态。此外，活性炭和2-(N-吗啉代)乙磺酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, MES）等培养环境改良剂分别通过吸附抑制性化合物和维持培养基稳定性来促进雄核发育胚胎发生。
3.3. 远缘杂交诱导
远缘杂交诱导是指通过杂交系统发育上相距较远、具有显著遗传隔离的植物类型（如种间或属间杂交）来产生单倍体植株的技术。由于亲本基因组结构的高度异质性，此类杂交常伴随染色体间不兼容性。机制上，通过远缘杂交形成单倍体可大致分为两种不同途径：花粉刺激的孤雌生殖（假配合，pseudogamy）和杂交胚形成后的选择性染色体消除。在特定条件下，父本花粉可作为生物刺激物触发卵细胞的孤雌生殖发育并诱导单倍体产生，即使父本遗传物质未与母本基因组发生实质性融合。相比之下，染色体消除介导的单倍体诱导涉及杂交胚的形成，随后在早期胚胎发生过程中选择性丢失一个亲本基因组的染色体。通过任一途径获得的单倍体植株可通过自发或秋水仙碱诱导的染色体加倍快速转化为完全纯合的DH群体，作为加速育种计划的宝贵遗传材料。此外，伴随远缘杂交中常见的异常染色体行为，该途径还带有一定概率产生染色体替换、易位或附加等染色体现象，从而生成对突变研究具有特殊价值的非整倍体材料。
远缘杂交诱导单倍体的研究可追溯至20世纪中期。1943年，Kostoff首次报道了通过烟草属内种间杂交获得单倍体植株，为该技术奠定了理论基础。随后，在禾本科作物中取得了里程碑式突破。1970年，Kasha以球茎大麦（Hordeum bulbosum）为父本、普通大麦（Hordeum vulgare）为母本进行远缘杂交，发现并建立了经典的"球茎大麦法"。这项工作证明了染色体消除机制的客观存在，成为植物单倍体领域的标志性突破。在蔬菜研究中，Vaulx于1979年将该技术引入葫芦科，通过远缘杂交成功获得南瓜单倍体。随着研究深入，该技术已在甜瓜和油菜（Brassica napus）等多种其他蔬菜作物中得到广泛验证和应用。这些研究不仅丰富了单倍体育种的理论框架，也为蔬菜作物的种质创新和遗传改良提供了重要平台。
3.4. 基因编辑介导的单倍体诱导系
基因编辑技术的突破为植物活体单倍体诱导开辟了全新途径。该方法主要依赖对调控生殖发育的关键功能基因进行精准编辑或定向敲除/修饰，从而构建单倍体诱导系。随后将这些诱导系与野生型植株杂交以诱导单倍体后代。利用这一策略，研究人员已在多种作物中成功构建了高效单倍体诱导系。目前，该领域研究主要集中于着丝粒组蛋白H3变体（CENH3）、磷脂酶基因（MTL/PLA1/NLD）、膜蛋白基因（DMP）和胚胎发生相关基因（BBM）等。借助CRISPR/Cas9等工具，已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄、西瓜和油菜等模式及作物物种中建立了稳健的单倍体诱导系统。根据其生物学功能，当前单倍体诱导相关基因可大致分为几个机制类别，包括着丝粒介导的染色体消除、与雄配子功能障碍相关的父本基因组消除、受精相关途径以及其他生殖调控机制。
3.4.1. 着丝粒介导的染色体消除：CENH3途径
CENH3（着丝粒组蛋白H3变体）是真核生物中负责着丝粒组装和功能维持的核心蛋白，在细胞分裂过程中对着丝粒定位和染色体分离起决定性作用。除其着丝粒功能外，修饰的CENH3已通过选择性单亲染色体消除成为单倍体诱导的有力工具，为活体产生单倍体植株提供了新策略。2010年，Ravi首次发现，在拟南芥cenh3突变体背景下表达功能受损的CENH3变体，与野生型杂交时可触发突变体基因组的完全消除，从而产生母本单倍体后代。这一开创性发现为通过CENH3途径进行人工单倍体诱导奠定了理论基础。随后，通过结合甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate, EMS）诱变和靶向诱导基因组局部突变（Targeting Induced Local Lesions in Genomes, TILLING），研究人员在拟南芥CENH3中鉴定出多个高度保守的氨基酸残基（如L130F、P82S和G83E）；相应的互补转基因系与野生型杂交时产生0.6%至12.2%的单倍体诱导率（haploid induction rate, HIR）。此外，使用CRISPR/Cas9直接创建CENH3移码突变也成功获得了优良单倍体诱导系。鉴于CENH3在真核生物中高度保守，该技术已扩展到玉米、大麦（Hordeum vulgare）和甜菜等作物。另外，采用RNA干扰（RNA interference, RNAi）适度下调CENH3表达，并结合外源功能互补，为在多倍体作物中开发单倍体诱导系提供了有前景的策略。
3.4.2. 雄配子功能障碍相关的父本基因组消除：MTL/PLA1/NLD和DMP途径
利用突变系进行单倍体诱导可追溯至20世纪中期。1959年，Coe等人鉴定出Stock6，一个作为花粉亲本时能以稳定频率诱导母本单倍体的自交亲和玉米自交系。这一特性使Stock6成为玉米DH育种中应用最广泛的诱导系。后续遗传定位揭示，Stock6衍生系的单倍体诱导能力由关键基因控制：ZmMTL/ZmPLA1/ZmNLD。2017年，Liu等人阐明了Stock6衍生系CAU5的分子机制，其中ZmPLA1第四外显子的4-bp插入导致翻译提前终止。该研究证实截短的磷脂酶蛋白是单倍体诱导的关键决定因素。进一步的多组学分析表明，ZmPLA1突变触发花粉中活性氧（reactive oxygen species, ROS）爆发，这在诱导单倍体过程中起关键作用；事实上，用ROS诱导剂处理野生型花粉也可刺激单倍体产生。
由于MTL/PLA1/NLD基因家族在单子叶植物中高度保守，它已成为单子叶作物工程化单倍体诱导系的核心靶点。例如，使用CRISPR/Cas9编辑水稻同源基因OsMATL，获得了HIR为2%至6%的水稻单倍体诱导系。在小麦中，基于CRISPR/Cas9的TaMTL敲除在双敲除突变体中实现了10%的HIR，在三敲除突变体中达到11.8%至31.6%。同样，玉米中CRISPR/Cas9介导的ZmMTL/ZmPLA1破坏持续产生HIR在2.0%至11.0%之间的单倍体诱导系。然而，由于该基因家族在双子叶蔬菜作物中表现出高度序列分化和功能分化，通过该途径在蔬菜中建立诱导系仍面临重大挑战，需要更深入地解析其双子叶同源物的功能进化。
ZmDMP是Zhong等人从玉米中克隆的另一个关键单倍体诱导基因；它编码一个含DUF679结构域的特异膜蛋白，在花粉发育后期高表达。研究表明，单独敲除ZmDMP即可诱导单倍体，但HIR较低，为0.1%至0.3%。与MTL不同，DMP基因在单子叶和双子叶植物中均高度保守，为在双子叶蔬菜作物中建立单倍体诱导系统提供了可行框架。在拟南芥中，同时编辑同源基因AtDMP8和AtDMP9获得了2.1%的HIR。该技术随后被应用于番茄、苜蓿（Medicago sativa）、油菜、马铃薯（Solanum tuberosum）和西瓜等双子叶物种。在甘蓝（Brassica oleracea）中，敲除BoC03.DMP9无论是通过自交还是作为父本测试者，均可诱导母本单倍体，HIR为0.41%至2.35%。在含有四个BnaDMP同源物的异源四倍体油菜中，多重CRISPR/Cas9靶向获得了2.4%至2.53%的HIR。这些同源物表现出剂量补偿效应，渐进的多基因突变可逐步提高诱导效率。
尽管MTL/PLA1/NLD和DMP介导的单倍体诱导系统大大扩展了活体单倍体生产工具箱，但其实际育种价值不能仅依据单倍体诱导率（HIR）来评估。基于MTL/PLA1/NLD的系统通常表现出较高的HIR，在优化的小麦突变体组合中报告值达31.6%，在玉米单倍体诱导系中达11.0%。然而，这些高诱导效率常伴随花粉功能和父本基因组传递的缺陷，可能因遗传背景不同而影响花粉竞争力、结实率和生殖稳定性。相比之下，DMP介导的单倍体诱导通常表现出相对较低的HIR，在不同作物中为0.1%至约2.5%，但DMP同源物在单子叶和双子叶植物中的保守分布及其对生殖性能的相对温和影响，使该途径对蔬菜作物特别有吸引力。因此，选择最佳单倍体诱导系统不仅应考虑最大HIR值，还应考虑生殖适应性、单倍体鉴定效率、遗传稳定性以及在不同种质中的可转移性。
3.4.3. 其他单倍体诱导相关基因
近期研究表明，通过修饰参与花粉信号传导、氧化稳态和配子互作的基因也可实现单倍体诱导。ZmPLD3和ZmPOD65均影响花粉相关信号传导过程，特别是ROS稳态，表明花粉微环境在单倍体诱导中起重要作用。2021年，Song等人发现了一个新的玉米基因ZmPLD3，其功能丧失可触发与mtl突变相当水平的单倍体诱导。有趣的是，两者之间存在协同效应；结合pld3和mtl突变可将HIR从1.19%提升至4.13%。此外，精子特异性过氧化物酶基因ZmPOD65的突变也被证明可触发单倍体，这一机制与花粉微环境中ROS稳态的破坏密切相关。KPL基因在雄配子中特异性表达，在维持双受精中起关键作用。在拟南芥中，破坏AtKPL（KOKOPELLI，AT5G63720）会损害配子互作并诱导单倍体胚形成，从而触发母本单倍体诱导。此外，细胞周期和减数分裂调控基因GIC1突变后可破坏配子发生，实现双向活体单倍体诱导。Bakhsh等人通过编辑GIC1成功在油菜中开发了一种新型活体单倍体诱导系统。
总的来说，单倍体诱导技术已从传统的离体方法（包括雌核发育和雄核发育）发展到基于染色体消除和基因编辑介导的单倍体诱导系的高级策略。尽管这些方法在机制和应用上有所不同，但它们为加速双单倍体系开发提供了有力工具。然而，它们在蔬菜作物中的应用仍受限于基因型依赖性、物种特异性反应以及对潜在分子机制的不完全理解。
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单倍体鉴定技术
单倍体鉴定是单倍体诱导技术实际应用中的关键步骤。在早期发育阶段快速准确识别单倍体种子或幼苗的能力直接决定染色体加倍效率和纯合系创制的整体速度。目前，单倍体鉴定方法包括直接倍性测定方法，如流式细胞术和染色体计数，以及基于形态性状、气孔特征、分子标记和可见报告系统的间接筛选方法。这些方法在发育时点、准确性、通量效率和物种适用性方面各有优劣，在实际育种计划中常联合使用。
4.1. 流式细胞术倍性分析
流式细胞术（flow cytometry, FCM）利用荧光染料特异性标记核DNA，精确量化其相对含量来估算倍性。FCM具有样品制备简单、处理速度快和定量精确等无可比拟的优势。它已被广泛用于黄瓜、甜瓜、西瓜、南瓜和油菜等多种蔬菜作物单倍体和DH的大规模快速筛选。然而，尽管FCM具有高通量和准确性，它需要专门仪器，且无法总是区分DNA含量相同但染色体异常不同的个体。因此，染色体计数常作为补充方法用于最终确认。
4.2. 染色体计数
染色体计数仍是确认倍性状态和染色体组成的经典细胞遗传学金标准。该方法通常涉及从根尖、花药或卷须等活跃组织制备压片，并在显微镜下直接观察染色体数目，以绝对可靠的方式确认倍性。该方法已成功用于检测小麦孤雌生殖后代和辐照花粉诱导黄瓜植株中的单倍体。此外，利用葫芦科作物特有的幼嫩卷须进行染色体压片已被证明是蔬菜倍性筛选的高效细胞遗传学途径。然而，某些核心蔬菜作物，如十字花科物种，其染色体形态高度相似且极其微小，使得染色体压片和计数在技术上颇为艰巨。由于该过程繁琐且劳动密集，无法满足大规模高通量筛选的需求。
4.3. 形态学鉴定
形态学鉴定是疑似单倍体个体最早且最简单的初步筛选方法。然而，由于形态性状受基因型、环境条件和发育阶段强烈影响，它们不能作为倍性的确定性指标。由于染色体组减半，单倍体植株通常在营养细胞和器官中表现出明显的"矮小"表型。这通常表现为生长活力降低、株型矮小、茎纤细、叶片狭窄、花器官较小和严重雄性不育。在马铃薯DH诱导研究中，研究人员基于叶、茎和花的形态异质性成功进行了初步倍性筛选。同样，在评估萝卜（Raphanus sativus）小孢子再生植株时，形态分析被证明可有效区分单倍体、DH和多倍体材料。然而，形态性状极易受环境波动影响，且需要大量植株生长才能出现诊断特征，因此存在评价周期长和准确性相对较低的问题。
4.4. 气孔保卫细胞评价
气孔保卫细胞评价是一种间接细胞学指标，可在确定倍性前进行初步筛选。其原理是植物倍性水平的变化会系统性改变气孔保卫细胞的尺寸、单位面积气孔密度以及每个保卫细胞内的叶绿体数量。在利用辐照花粉诱导黄瓜单倍体的研究中，保卫细胞内叶绿体计数使研究人员能够清晰区分单倍体、DH和三倍体材料。同样，在鉴定西葫芦（Cucurbita pepo）离体未授粉子房培养再生植株时，研究人员利用气孔特征和叶绿体计数双重指标成功确定再生群体中绝大多数为二倍体。该方法的主要优点在于操作简单且不依赖昂贵仪器，便于高通量苗期预筛。然而，准确性可能受叶片生理状态、取样位置和环境生长条件干扰。因此，它通常作为辅助工具，需通过染色体计数或流式细胞术等确定性方法进行后续验证。
4.5. 基于分子标记的鉴定
基于分子标记的鉴定为验证单倍体衍生后代的遗传来源和遗传稳定性提供了稳健的分子方法。传统标记系统，如随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA, RAPD），已被广泛用于区分母本和父本遗传贡献。通过利用亲本间的多态性引物，RAPD分析可通过母本特异性条带的存在和父本特异性条带的缺失来确认孤雌生殖来源。然而，由于RAPD标记是显性标记且重现性可能相对较差，其应用常限于初步鉴定。
简单序列重复（simple sequence repeat, SSR）标记具有共显性遗传、重现性高和检测程序相对简单的特点，被广泛用于评估黄瓜、甜瓜和南瓜等作物再生单倍体和双单倍体植株的遗传纯度和纯合性。然而，SSR分析通常依赖有限数量的位点，可能无法提供全基因组范围的全面表征。
随着分子育种技术的发展，高密度单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）标记系统在单倍体鉴定中日益重要。SNP标记提供全基因组信息，具有高通量平台，并能精确评估染色体组成和遗传均匀性。这些标记系统为确认单倍体来源、评估全基因组纯合性和加速双单倍体系开发提供了更全面、更精确的工具。
除标记开发外，转录组学、蛋白质组学和表观基因组学分析有助于鉴定参与单倍体诱导、胚胎发生和染色体消除的候选基因和调控网络。例如，单倍体诱导系的比较基因组和转录组分析促进了MTL/PLA1/NLD等关键基因的鉴定，这些基因随后为CRISPR/Cas9介导的单倍体诱导系开发提供了靶点。因此，将组学方法与常规分子鉴定方法和基因组编辑技术相结合，是提高单倍体育种系统效率和精度的有效策略。
4.6. 基于可见标记的鉴定
基于可见标记的鉴定依赖于将显性表型报告基因整合到诱导系背景中。这使得诱导后代在种子发育或早期幼苗阶段表现出肉眼可辨的表型，便于高通量、早期单倍体分选。花青素遗传标记是玉米单倍体鉴定中最早部署的系统之一。通过将花青素调控基因R1-nj整合到诱导系中，利用其组织特异性表达产生胚乳糊粉层和胚盾片中的紫色花青素色素沉着来实现筛选。在R1-nj诱导系与正常母本杂交产生的杂种后代中，二倍体种子在胚和胚乳中均显示紫色。相比之下，单倍体种子显示紫色胚乳但白色胚，而自交污染种子则呈现完全白色胚和胚乳。然而，R1-nj系统的有效性并非完全普遍，标记表达可能受母本遗传背景、内源花青素色素沉着和类黄酮生物合成途径调控变异的影响。这些因素可能降低某些遗传材料中单倍体视觉区分的准确性。由于其简单、高效和低成本，该系统是玉米单倍体诱导的标准做法。同样，通过利用ZmC1和ZmR基因调控花青素合成，为小麦开发了紫色胚芽鞘诱导系（HIPC），允许基于胚芽鞘颜色进行精确单倍体区分，准确率超过96.3%。
高油标记系统利用玉米胚占种子总含油量85%以上的事实，通过高油诱导系与标准材料杂交后籽粒油浓度的差异来鉴定单倍体。籽粒油含量可使用核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）技术进行高通量监测。然而，绝大多数主要蔬菜作物（如十字花科、葫芦科和茄科）缺乏单子叶禾本科作物典型的糊粉层，且其种皮常含有内源色素。加之蔬菜种子通常属于低脂类别，这些生物学差异对经典花青素和高油标记系统在蔬菜单倍体育种中的直接适应和采用构成了固有约束。
因此，通过转基因或基因编辑工程化的荧光蛋白标记系统是双子叶蔬菜作物最有前景的活体精准鉴定技术。该架构通过将特定启动子与编码荧光报告蛋白（如增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, eGFP）或红色荧光蛋白（DsRED））的基因融合，并将其导入活体单倍体诱导系来实现。例如，在玉米zmmtl诱导系中，用胚特异性启动子驱动eGFP、胚乳特异性启动子驱动DsRED，产生的单倍体种子表现为胚无荧光和胚乳红色荧光。相比之下，杂交二倍体种子表现为胚绿色荧光和胚乳红色荧光。在黄瓜中，将GFP标记连接到诱导系上，可在早期种子萌发期间直接进行荧光可视化。这允许育种者丢弃绿色荧光的杂交二倍体，从而精确分离和批量分选无荧光的单倍体突变种子。凭借其鲜明对比、高准确性和适合自动化批量操作，荧光分选系统显著加速了单倍体育种技术的演进。
总之，园艺作物单倍体鉴定方法已从经典形态学观察和细胞遗传学染色体计数，逐步发展到流式细胞术、分子标记和遗传标记辅助筛选，诊断效率和准确性稳步提高。虽然细胞遗传学压片计数仍是不可替代的基准方法，但扩展到工业诱导群体中数万个个体，决定了蔬菜单倍体筛选的未来突破必须聚焦于将通用活体基因编辑技术（如DMP或CENH3敲除）与荧光蛋白筛选架构相结合。在种子阶段实现高通量、精准分选将为DH育种的大规模产业化提供基础支撑。然而，由于不同作物在遗传背景、种子生理和标记表达谱方面存在显著差异，实际应用必须针对每种作物的生物学参数进行细致定制。
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优化染色体加倍和DH系建立
尽管单倍体诱导技术已取得重大进展，但双单倍体系的成功建立最终取决于高效的染色体加倍。染色体加倍恢复单倍体植株的二倍体染色体组，从而恢复减数分裂稳定性和可育性，同时为育种应用产生完全纯合系。然而，染色体加倍效率在作物物种、基因型和实验系统间仍高度可变，是限制DH技术实际利用的关键瓶颈，在蔬菜作物中尤其如此。
自发染色体加倍可在单倍体再生或后续植株发育过程中发生，在某些物种中对DH形成有显著贡献。然而，自发加倍频率通常不可预测，且受遗传背景、再生途径和环境条件强烈影响。因此，对许多育种计划而言，人工染色体加倍仍是实现可靠和大规模DH生产所必需的。
秋水仙碱仍是使用最广泛的染色体加倍剂，通过破坏纺锤体形成并恢复单倍体细胞中的二倍体染色体数目来发挥作用。然而，其效率随浓度、处理持续时间、发育阶段和组织类型而变化，不当处理可能导致植物毒性或不完全加倍，产生混倍体等异常倍性结果。为克服这些限制，已探索了替代抗微管化合物，包括安磺灵（oryzalin）、氟乐灵（trifluralin）和甲基胺草磷（amiprophos-methyl, APM）。这些化合物与植物微管蛋白相互作用，在某些条件下可能提供有效且毒性较低的染色体加倍。
未来DH技术的改进需要开发更高效且基因型无关的染色体加倍策略，特别是针对顽固性蔬菜作物。将优化的加倍方案与高通量倍性筛选、精准单倍体诱导系统和自动化育种平台相结合，对于将DH技术从专门方法转变为加速蔬菜改良的广泛适用工具至关重要。
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主要蔬菜作物研究进展
6.1. 十字花科作物进展
目前，十字花科作物的单倍体诱导研究主要集中在游离小孢子诱导。自1982年Lichter首次报道油菜小孢子再生植株以来，该技术已在广泛的十字花科蔬菜中得到充分记载。然而，该方法仍受到极端基因型依赖性的严重制约。完全克服这种基因型限制并同时提高胚-苗转化率仍是未来研究中亟待解决的关键挑战。
近年来，通过基因编辑技术创建活体单倍体诱导系统已逐步在十字花科作物中采用，为规避游离小孢子培养的基因型依赖性瓶颈提供了新范式。着丝粒组蛋白H3（CENH3）是调控着丝粒功能的关键蛋白。研究表明，使用CRISPR/Cas9敲除内源CENH3，并结合转基因表达功能受损的CENH3变体（如N端缺失或绿色荧光蛋白融合蛋白），可成功生成单倍体诱导系。当该诱导系与野生型（WT）杂交时，其染色体在受精后有丝分裂期间无法正确附着纺锤丝并随后丢失，从而产生仅含对侧亲本染色体的单倍体后代。遵循这一机制，研究人员通过编辑CENH3成功在芸苔属物种中诱导单倍体，HIR为0.20%至1.32%。此外，DMP（功能未知结构域679膜蛋白）已成为在单子叶和双子叶植物中均保守的通用单倍体诱导基因。在模式十字花科物种拟南芥中，敲除AtDMP可产生约2%至3%的自发母本单倍体频率。在十字花科蔬菜作物中，用精准基因编辑工具靶向DMP直系同源物已显示出巨大潜力。例如，在异源四倍体油菜中敲除BnaDMP，通过自交或杂交均可产生稳定频率的原位单倍体。在甘蓝中，破坏BoC03.DMP9成功诱导母本单倍体，HIR为2.35%。在芥菜（Brassica juncea）中，通过靶向编辑BjuDMPs成功产生母本单倍体。这些里程碑式研究为在其他重要经济十字花科作物中部署活体单倍体诱导奠定了坚实基础。
6.2. 茄科作物进展
在茄科中，辣椒的雄核发育已取得重要里程碑。虽然目前可通过花药和游离小孢子培养两种方式获得单倍体，但小孢子培养技术尚未完全克服强基因型限制，低胚诱导率和植株再生困难仍是普遍问题。相比之下，番茄长期以来被归类为对传统单倍体诱导途径高度顽固的物种，传统花药培养效率极低且重现性差。为打破这一僵局，近期研究重点转向通过基因编辑工程化活体单倍体诱导系。2022年，通过敲除番茄中的SlDMP基因，研究人员成功构建了活体单倍体诱导系，HIR可达1.9%至3.9%。该技术的成功部署标志着番茄育种范式的转变，使育种者能够绕过复杂的离体组织培养流程，通过简单杂交直接在母本植株上筛选单倍体种子。此外，虽然茄子（Solanum melongena）的单倍体诱导历史上依赖花药培养框架，当前研究正积极转向游离小孢子培养和基因编辑介导的单倍体诱导。
6.3. 葫芦科作物进展
与十字花科和茄科蔬菜中广泛利用的雄核发育途径形成鲜明对比，葫芦科作物（如黄瓜、甜瓜和西瓜）对雄配子体胚胎发生高度顽固。因此，该科单倍体的获得历史上依赖离体雌核发育和辐照花粉诱导的孤雌生殖。在葫芦科单倍体育种早期阶段，单倍体诱导主要通过用辐照灭活花粉授粉来驱动。1987年，研究人员利用钴-60伽马射线（60Co-rays）处理花粉进行授粉，随后离体拯救和培养胚珠或未成熟胚，成功获得哈密瓜（Cucumis melo）单倍体植株。随后，该方法被扩展和优化用于其他葫芦科作物，包括西瓜、甜瓜和黄瓜。随着组织培养方法的发展，研究焦点转向离体未受精胚珠或子房培养（雌核发育），在黄瓜和西瓜中取得了显著成功。近期，受分子生物学进展推动，通过基因编辑构建活体单倍体诱导系已成为葫芦科领域的研究热点。2022年，一个研究团队通过CRISPR/Cas9精准敲除ClDMP基因，成功在西瓜中建立了活体单倍体诱导系统，HIR高达1.12%。同样，在黄瓜中，敲除CsDMP基因成功触发单倍体诱导，HIR为0.09%至0.49%。这些突破有效打破了葫芦科长期依赖繁琐离体组织培养方案的僵局，为该科快速产生纯合系提供了全新战略工具集。
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挑战与未来展望
尽管
