异源表达中的表观遗传学设计变量：伯克霍尔德菌FERM BP-3421 DNA甲基转移酶的功能解析与应用

《Applied and Environmental Microbiology》：Epigenetics as a design variable in heterologous expression

摘要 异源表达——将基因从一种生物转入另一种生物进行表达——是生产蛋白质和代谢物等高附加值化学品的重要途径。然而，其主要挑战在于实现商业可行的产量。目前用于提高产量的策略依赖于编辑DNA序列，包括启动子、核糖体结合位点和密码子使用。表观遗传学，即DNA甲基化，可能提供额外的调控层以改善产量，但尚未被探索。此外，宿主生物的选择至关重要。研究人员一直致力于开发替代性细菌宿主伯克霍尔德菌（Burkholderia sp. FERM BP-3421）。在该菌株的基因组中预测到四个编码DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase）的基因，其中有一个在研究人员所用的生长条件下处于沉默状态。通过基因敲除或过表达，研究人员实验性地确定了每种DNA甲基转移酶的识别基序（recognition motif），其中一个被证明是必需的。正如预期，DNA甲基化的调控对宿主的转录组（transcriptome）和代谢组（metabolome）产生了显著影响，其变化取决于被修饰的是哪种DNA甲基转移酶。两个甲基化腺嘌呤（adenine）的甲基转移酶具有重叠的效应谱，而甲基化胞嘧啶（cytosine）的那个则有所不同。最后，研究人员利用绿色荧光蛋白（green fluorescence protein, GFP）和三种不同的启动子，探究了DNA甲基化在异源表达过程中的作用。表达水平以一种上下文依赖的方式发生变化，其机制在某些情况下涉及启动子区域内甲基化基序的存在，但也基于全局性的宿主效应。这项工作确立了表观遗传学作为帮助提高异源表达产量的重要设计变量。

论文解读：表观遗传学作为异源表达的设计变量

一、研究背景与科学问题

异源表达（heterologous expression）是将外源基因导入宿主生物中进行表达，已成为生产重组蛋白和次级代谢产物（如人胰岛素和青蒿素）的关键技术。尽管其在满足生物医药需求和发现新型天然产物方面潜力巨大，但成功率较低（文献报道仅为30%左右）。目前，提升异源表达效率的主流策略集中于DNA序列层面的优化，例如更换启动子（promoter）、优化核糖体结合位点（ribosome binding site, RBS）以及调整密码子偏好性（codon usage）。然而，这些方法并未充分挖掘宿主细胞自身的调控潜力。近年来，宿主本身已被视为一个重要的设计变量，但表观遗传学（epigenetics）——特别是细菌中主要的表观遗传修饰形式DNA甲基化（DNA methylation）——在异源表达中的应用仍属空白。细菌DNA甲基化（形成N⁶-甲基腺嘌呤m⁶A、N⁴-甲基胞嘧啶m⁴C和C⁵-甲基胞嘧啶m⁵C）已知参与限制-修饰系统（restriction-modification system, R-M system）、细胞周期控制、DNA修复、基因转录调控以及天然产物合成的调节。因此，本研究旨在探索将表观遗传学作为一个新的设计维度，通过调控宿主菌的DNA甲基化模式来改善异源表达产量。研究人员选择了一种具有潜力的替代性细菌宿主——伯克霍尔德菌（Burkholderia sp. FERM BP-3421），该菌株已成功用于发现多种来自伯克霍尔德菌目的天然产物。

二、主要研究方法与技术

本研究采用了多种关键技术。首先，利用牛津纳米孔测序（Oxford Nanopore sequencing）和MicrobeMod流程对野生型菌株的全基因组甲基化图谱进行分析。其次，通过同源重组（homologous recombination）技术对预测的DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase, MTase）基因进行框内缺失或启动子替换以实现过表达。再次，运用RNA测序（RNA-seq）技术分析甲基转移酶突变体的全转录组变化。最后，采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）的非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）分析突变体的代谢物谱变化。异源表达效果通过测量不同启动子驱动下的绿色荧光蛋白（green fluorescence protein, GFP）荧光强度来评估。

三、研究结果

DNA甲基转移酶及其基序鉴定

研究人员在FERM BP-3421基因组中预测到四个DNA甲基转移酶基因：m.burI（属于III型R-M系统）、m.burII（属于II型R-M系统）、m.burIV（孤儿型II型MTase）和m.burV（位于原噬菌体区域的孤儿型II型MTase）。RNA-seq显示，前三者在所试条件下具有转录活性，而m.burV处于沉默状态。通过构建m.burI和m.burIV的缺失突变体，并结合纳米孔测序，研究人员将M.BurI的识别基序确定为CAC^m6AG，M.BurIV的识别基序为GTWW^m6AC。M.BurII的基序（SAG^m4CTS）通过排除法确定。值得注意的是，m.burII被证明是必需基因，因为只有在额外提供一个质粒拷贝的情况下才能删除染色体上的该基因。为了鉴定M.BurV的基序，研究人员通过启动子替换激活了其表达，并在m.burV⁺过表达菌株中发现了一个新的甲基化基序C^m4CAG。

甲基转移酶突变对宿主生长的影响

除了M.BurII的必需性外，其他三个甲基转移酶的缺失或过表达均导致宿主总体生长略有下降，其中Δm.burI突变体的生长减少最为显著。

甲基转移酶突变对宿主转录组的影响

转录组分析显示，Δm.burI、Δm.burIV和m.burV⁺突变体中分别有282、193和543个基因差异表达（differentially expressed, DE）。缺失突变体中下调基因居多，而过表达突变体中上调基因居多。Δm.burI和Δm.burIV突变体的差异表达基因有大量重叠（前50个差异表达基因中有41个共享），表明两者调控相似的生物学过程。这些基因主要涉及细胞壁生物合成、能量产生、运动性和次级代谢（如spliceostatin生物合成基因簇）。m.burV⁺突变体中差异表达的基因则主要集中在翻译、细胞壁生物合成和转录类别，尤其是核糖体蛋白基因显著上调。此外，所有突变体中都观察到多个天然产物生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster, BGC）相关基因的表达发生变化，包括一些孤儿BGC的上调。

甲基转移酶突变对宿主代谢组的影响

非靶向代谢组学分析结果与转录组数据一致。Δm.burI和Δm.burIV突变体中大多数检测到的代谢物特征下调，而m.burV⁺过表达突变体中则以上调为主。例如，spliceostatin在缺失突变体中含量降低。重要的是，在所有三个突变体中都发现了野生型中不存在的独特代谢物特征，这为未来的天然产物发现提供了机会。

DNA甲基化对异源表达的影响

研究人员测试了三种不同启动子在甲基转移酶突变体中介导GFP表达的效果：

1. 1.
   P_fr9C启动子（来自spliceostatin BGC，含一个M.BurI基序）：在Δm.burI突变体中，GFP荧光显著降低约45%。通过定点诱变去除该启动子区域内的M.BurI基序后，GFP表达得到改善但仍未达到野生型水平，表明M.BurI的甲基化对该启动子的活性有正向调控作用。
2. 2.
   P_S12-S7启动子（组成型，含一个M.BurIV基序和两个M.BurV基序）：在Δm.burIV突变体中GFP表达无显著变化。然而，在Δm.burI和m.burV⁺突变体中，GFP表达分别提高了2.4倍和2倍。去除M.BurIV基序无影响，而去除两个M.BurV基序则消除了m.burV⁺突变体中的增强效应，这与M.BurV甲基化促进核糖体基因（包括s12）表达的结果一致。
3. 3.
   P_BAD启动子系统（来自大肠杆菌的阿拉伯糖诱导型，含M.BurI和M.BurIV基序但在启动子本身之外）：在所有突变体中，GFP表达与野生型相比均无显著差异。

这些结果表明，表观遗传学对异源表达的影响是上下文依赖的，既可能源于启动子区域中甲基化基序的直接作用，也可能源于全局性的宿主生理状态改变。

四、讨论与结论

本研究首次系统地证明了细菌宿主表观遗传学状态可以作为一种设计变量来优化异源表达。研究人员通过实验鉴定了四种DNA甲基转移酶的识别基序，其中M.BurII被证实是必需基因。转录组和代谢组分析揭示了DNA甲基化对宿主全局基因表达和代谢网络具有广泛而深刻的影响，尤其体现在天然产物生物合成基因簇的调控上。在异源表达实验中，通过调控特定的DNA甲基转移酶（如敲除m.burI或过表达m.burV），研究人员观察到了最高达2.4倍的GFP表达提升。这种效应的机制是多方面的，包括直接作用于启动子区域的甲基化基序，以及间接改变宿主整体的转录和翻译环境。结论指出，宿主和质粒载体的表观遗传学都能影响异源表达的结果，这为未来开发更高效的异源表达宿主和优化表达策略提供了一个全新的视角。该研究强调了在宿主开发和异源表达过程中关注表观遗传学的重要性。