植物病原体木质部难养菌中Rep-WH1朊病毒样蛋白的聚集与毒性研究

《Applied and Environmental Microbiology》：Aggregation and toxicity in bacteria of Rep-WH1 prion-like proteins from the phytopathogen Xylella fastidiosa

　　

木质部难养菌（Xylella fastidiosa）是一种全球性的细菌性植物病原体，可定殖于木质部导管并导致其堵塞，进而引起植物死亡。来自丁香假单胞菌（Pseudomonas savastanoi）pPS10质粒的复制蛋白RepA的类淀粉样生成性、朊病毒样WH1结构域的表达会严重损伤大肠杆菌（Escherichia coli）细胞。本研究对来自木质部难养菌pXF51和pXF64质粒的Rep蛋白中的WH1结构域进行了表征。与来自pPS10的原型RepA-WH1蛋白相似，这些Rep-WH1蛋白的表达降低了大肠杆菌的体外可培养性，促进了细胞的休眠。pXF51 Rep-WH1的表达使杆状细胞转化为大型球菌，在该细胞中该蛋白形成水凝胶；而pXF64 Rep-WH1则像pPS10 RepA-WH1一样生成致密的类淀粉样聚集体，从而定义了不同的蛋白质特异性相分离。在木质部难养菌中，Rep-WH1蛋白同样通过破坏细胞包膜完整性来降低可培养性，驱使细菌细胞进入休眠状态；同时，与一部分木质部难养菌宿主蛋白的共聚集可能有助于降低细菌在植物中的致病性。这些发现为利用内源性质粒编码的Rep蛋白固有的类淀粉样生成潜力来控制木质部难养菌开辟了途径，旨在减少其经济和环境影响。

一、研究背景与目的

木质部难养菌（Xylella fastidiosa）是一种全球性的革兰氏阴性细菌植物病原体，可感染超过700种植物物种，导致严重的病害并造成巨大的经济损失。该细菌通过吸食汁液的半翅目昆虫传播，在木质部导管内系统性扩散并形成生物膜，最终堵塞导管导致植物枯萎。由于缺乏有效的根除手段，开发新型防控策略迫在眉睫。

此前研究发现，来自丁香假单胞菌（Pseudomonas savastanoi）pPS10质粒的复制起始蛋白RepA的WH1结构域（RepA-WH1）具有类淀粉样生成性和细胞毒性，在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达时会形成朊病毒样聚集体，损害细胞内膜并导致细胞毒性。受此启发，研究人员旨在探索木质部难养菌自身质粒编码的Rep蛋白的WH1结构域是否也具有类似的聚集和毒性特性，以期利用这一内源性机制开发针对该病原体的新型控制方法。

二、研究方法

研究人员首先通过BLAST搜索，从木质部难养菌质粒的Rep蛋白中鉴定出与pPS10 RepA-WH1序列一致性大于40%的WH1结构域，并选取了分别来自pXF51质粒（亚种 pauca 菌株XRB）和pXF64质粒（亚种 multiplex 菌株ESVL）的两个代表性WH1蛋白（WH1_pXF51 和 WH1_pXF64）进行实验研究。主要技术方法包括：

1. 1.
   生物信息学预测：使用AlphaFold2进行蛋白质三维结构预测，并使用AMYLPRED和AGGREPROT等工具分析其类淀粉样生成潜力。
2. 2.
   异源表达与荧光显微成像：将WH1结构域与单体红色荧光蛋白mCherry（mCh）融合，分别在模式生物大肠杆菌和木质部难养菌（亚种 fastidiosa 菌株IVIA5235）中进行诱导表达。通过常规荧光显微镜和受激发射损耗（STED）超分辨率显微镜观察蛋白聚集形态和细胞形态变化。
3. 3.
   细胞生理与生化分析：采用荧光漂白恢复（FRAP）技术评估蛋白在活细胞内的流动性；使用硫黄素-S（Th-S）染色检测类淀粉样结构；利用1,6-己二醇处理区分水凝胶与固态聚集体；通过BacLight Green染色评估细胞包膜完整性；并结合差速离心和免疫印迹法分析蛋白的可溶性分布。
4. 4.
   蛋白质组学分析：分离与WH1-mCh聚集体共沉淀的宿主蛋白组分，通过液相色谱-串联质谱（LC-ESI-MS/MS）鉴定被共捕获的宿主蛋白，并利用STRING数据库构建蛋白关联网络。
5. 5.
   超微结构观察：使用透射电子显微镜（TEM）观察表达WH1蛋白后木质部难养菌细胞的超微结构损伤。

三、研究结果

1. 木质部难养菌质粒的复制蛋白（Rep）具有含类淀粉样生成潜力的WH1结构域

研究人员通过生物信息学分析，确认了WH1_pXF51和WH1_pXF64均含有与WH1_pPS10相似的保守类淀粉样生成片段。AlphaFold2结构预测显示，WH1_pXF51的结构与WH1_pPS10高度相似，而WH1_pXF64则缺少N端α1螺旋，代之以一个β-发夹结构。

2. 在大肠杆菌中表达Rep-WH1聚集体的表型和毒性差异

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  细胞形态与蛋白聚集差异：在大肠杆菌MDS42中表达不同WH1-mCh融合蛋白，观察到显著的表型差异。WH1_pPS10-mCh导致细胞伸长（丝状化）并形成多个细胞内荧光焦点（聚集体）。WH1_pXF64-mCh主要在细胞两极形成球状聚集体，细胞形态基本正常。WH1_pXF51-mCh则戏剧性地将杆状细胞转变为大型球形细胞，荧光呈弥散分布。STED超分辨成像揭示，WH1_pXF51-mCh在细胞内形成了复杂的非均质基质，推测为水凝胶，并将核区排挤至细胞边缘。1,6-己二醇处理可使该水凝胶部分溶解，核区重新定位。FRAP实验证实了WH1_pXF51-mCh形成的网状结构中存在可扩散的蛋白储库。
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  对细菌适应性的影响：平板培养实验表明，表达WH1_pPS10-mCh使大肠杆菌可培养性下降10倍，而表达WH1_pXF51-mCh和WH1_pXF64-mCh则导致10³至10⁴倍的下降。BacLight Green染色显示，大部分表达WH1-mCh的细胞并未出现严重的包膜破损，表明它们可能进入了可逆的休眠状态而非直接死亡。

3. 在木质部难养菌中表达Rep-WH1聚集体的表型和毒性差异

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  在木质部难养菌中表达WH1-mCh蛋白：由于pRK2载体在木质部难养菌中无法有效表达，研究人员将其克隆到带有3-甲基苯甲酸（3-MBz）诱导型启动子的pSEVA138高拷贝载体中。WH1_pXF64-mCh因毒性过高未能成功转化。
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  WH1-mCh表达导致与大肠杆菌不同的表型：在木质部难养菌IVIA5235中，表达WH1_pPS10-mCh和WH1_pXF51-mCh均未引起细胞形态改变。WH1_pPS10-mCh形成弥散的荧光焦点，而WH1_pXF51-mCh荧光呈弥散分布。STED成像显示两者均形成聚集体，但WH1_pXF51-mCh的聚集体较小且位于细胞周边。
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  对木质部难养菌适应性的影响：WH1_pPS10-mCh的表达导致木质部难养菌可培养性显著下降（至少10³倍），且大多数存活细胞失去了荧光表达，表明其毒性极强。WH1_pXF51-mCh的影响相对温和。BacLight Green染色结果再次支持细胞进入休眠状态的观点。
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  与每种朊病毒样蛋白共沉淀的蛋白质组指向不同的毒性通路：蛋白质组学分析发现，与WH1_pPS10-mCh共沉淀的宿主蛋白主要涉及外膜脂多糖（LPS）合成和原噬菌体裂解蛋白；而与WH1_pXF51-mCh共沉淀的蛋白则主要涉及内膜醌/NAD(P)H氧化还原酶和核糖体蛋白。这表明两种蛋白通过不同途径损害细胞，分别影响细胞包膜完整性和呼吸链功能。
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  表达WH1_pPS10/pXF51-mCh朊病毒导致木质部难养菌细胞超微结构水平上的广泛损伤：TEM观察显示，表达WH1_pPS10-mCh的细胞出现大量细胞碎片，符合细胞裂解的特征；而表达WH1_pXF51-mCh的细胞则出现变形，形成类似大肠杆菌L型细胞的异常巨大囊泡，暗示其受到氧化性包膜应激。

四、讨论与结论

本研究表明，来源于木质部难养菌质粒的Rep-WH1蛋白（WH1_pXF51和WH1_pXF64）具有与原型WH1_pPS10相似的类淀粉样生成潜力，但在聚集形态和毒性表现上存在差异。WH1_pPS10和WH1_pXF64形成致密的类淀粉样聚集体，而WH1_pXF51则优先形成一种可逆的水凝胶中间态。这些蛋白的表达均会损害细菌的适应性，其主要机制并非直接杀死细胞，而是驱动其进入一种可逆的休眠状态。

在木质部难养菌中，这些朊病毒样蛋白通过与多种关键的宿主蛋白（如参与运动、粘附、能量代谢、LPS合成及抗氧化防御的蛋白）发生共聚集，可能削弱细菌的致病力。尽管尚未进行植物体内感染实验验证，但体外超微结构观察到的严重细胞损伤为此提供了有力证据。

结论：研究人员得出结论，内源性质粒编码的Rep-WH1蛋白的类淀粉样聚集特性代表了木质部难养菌的一个脆弱点。通过将Rep-WH1作为“特洛伊木马”递送至病原菌（例如通过接合转移或溶源性噬菌体），或筛选能够特异性触发内源Rep蛋白毒性聚集的小分子化合物，有望发展出一种全新的、具有高度特异性和最小生态干扰的木质部难养菌控制策略。这项工作为利用朊病毒样蛋白对抗植物病原体开辟了新的道路。