《Bioactive Materials》：A temporally responsive anti-scarring and pro-neuronal differentiation dual-targeting composite hydrogel fabricated via AI-assisted design and loaded with neural stem cells for spinal cord injury repair
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摘要专业翻译：
本研究开发了一种基于人工智能（AI）辅助设计的新型靶向转化生长因子-β（TGF-β）的溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）多肽（EndoP144），用于脊髓损伤（SCI）修复。该多肽通过基质金属蛋白酶-2（MMP-2）响应性可裂解连接子与甲基丙烯酰化
摘要专业翻译：
本研究开发了一种基于人工智能（AI）辅助设计的新型靶向转化生长因子-β（TGF-β）的溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）多肽（EndoP144），用于脊髓损伤（SCI）修复。该多肽通过基质金属蛋白酶-2（MMP-2）响应性可裂解连接子与甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶骨架偶联，实现损伤微环境中时序可控的瘢痕调控释放。研究人员进一步构建了负载Notch1小干扰RNA（si-Notch1）的M2巨噬细胞来源杂交外泌体（Hybrid-Exo），通过吡唑啉酮苯甲酸功能化的丝素蛋白纳米颗粒（b-SFN）实现外泌体的长效缓释与体内长时间滞留。该EnpMG-bSH复合水凝胶系统集抗瘢痕形成、抗炎微环境重塑及神经干细胞（NSC）神经元定向分化调控于一体，为SCI修复提供了一种多靶点协同干预的综合性治疗平台。
论文解读文章：
脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是一种严重致残的中枢神经系统创伤性疾病，其病理过程涉及成熟神经元不可逆坏死与凋亡、剧烈炎症反应以及过度胶质瘢痕形成等多个相互交织的环节，形成恶性循环，导致神经功能恢复困难、临床预后差。目前，基于功能性水凝胶的神经干细胞（neural stem cell, NSC）递送与移植策略被认为是SCI治疗最具前景的方向之一，能够在损伤部位补充丢失的神经元、动态调控病理微环境并精准激活神经再生程序。然而，现有研究大多聚焦于改善炎症微环境和促进神经再生，针对抑制胶质瘢痕形成的生物材料体系相对匮乏。胶质瘢痕主要由星形胶质细胞异常活化形成，是阻碍轴突生长和神经环路重建的物理及化学屏障。转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）被证实是SCI病理进程中胶质瘢痕形成的核心上游调控因子，在亚急性期和慢性期持续高表达，驱动星形胶质细胞过度活化并诱导硫酸软骨素蛋白聚糖（chondroitin sulfate proteoglycans, CSPGs）等瘢痕基质成分大量分泌。传统TGF-β靶向治疗以中和抗体为主，仅能阻断其生物活性而无法清除损伤微环境中持续累积的TGF-β，难以实现长期稳定的治疗效果。溶酶体靶向嵌合体（lysosome-targeting chimeras, LYTACs）作为一种新兴的靶向蛋白降解技术，能够介导细胞外靶蛋白的内吞并转运至溶酶体进行特异性降解，为TGF-β的靶向清除提供了新思路，但在中枢神经系统损伤领域的研究仍十分有限。此外，NSC移植后难以自发分化为成熟神经元并跨越损伤界面形成连续神经环路，是限制神经再生的另一大瓶颈。Notch1信号通路是调控NSC分化命运的核心通路，其下调已被证实可促进NSC的神经元分化。因此，开发一种能够同时靶向抑制胶质瘢痕形成并精准调控NSC分化命运的多功能水凝胶递送系统，对于SCI修复具有重要的临床意义。
针对上述问题，研究人员设计并构建了一种时序响应型双靶向多功能复合水凝胶系统（EnpMG-bSH），并负载NSC用于SCI修复。该系统包含三个核心组分：一是通过AI辅助设计优化的新型TGF-β靶向LYTAC多肽EndoP144，经MMP-2可裂解连接子偶联至GelMA骨架，实现损伤部位MMP-2上调时的按需释放；二是将M2巨噬细胞来源外泌体与负载Notch1 siRNA（si-Notch1）的脂质体膜融合构建杂交外泌体（Hybrid-Exo），兼具M2外泌体固有抗炎活性和Notch1基因沉默功能；三是采用吡唑啉酮苯甲酸修饰的丝素蛋白纳米颗粒（b-SFN）通过粘附吸附装载Hybrid-Exo，实现外泌体的长效滞留与持续释放。该研究发表在《Bioactive Materials》期刊上。
在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键策略：利用AI辅助计算筛选流程（包括RFdiffusion模型序列生成、AlphaFold3结构预测及多指标加权排序）设计并筛选最优EndoP144多肽序列；采用铜催化叠氮-炔环加成（CuAAC）和硫醇-烯化学将EndoP144通过MMP-2响应性连接子共价偶联至GelMA骨架；通过膜融合技术将M2巨噬细胞来源外泌体与si-Notch1负载脂质体融合构建Hybrid-Exo；利用吡唑啉酮苯甲酸与膜蛋白的稳定吸附作用对丝素蛋白纳米颗粒进行功能化修饰，实现外泌体的高效装载与缓释。动物实验采用小鼠脊髓半横断损伤模型，移植LV-EGFP标记的NSC进行体内命运追踪及功能评估。
研究结果部分，首先在材料表征方面，研究人员证实EnpMG-bSH水凝胶具有良好的光固化性能（405 nm光照15秒内快速凝胶化）、适度的溶胀率和降解速率、稳定的流变学特性以及良好的生物粘附性。通过考马斯亮蓝染色、UHPLC-MS和MALDI-TOF-MS分析验证了MMP-2响应性释放行为，证实EndoP144能够在损伤微环境MMP-2升高的条件下按需释放。在EndoP144的设计与功能验证方面，通过分析公共单核RNA测序（snRNA-seq）数据集发现IGF2R在SCI损伤部位广泛表达且在星形胶质细胞、少突胶质细胞和炎性免疫细胞中显著上调。AI辅助设计筛选出的GGS连接子序列在抑制星形胶质细胞活化方面效果最佳，且优于传统柔性(GGGGS)3和刚性(EAAAK)3连接子。免疫荧光和Western blot实验证实EndoP144较P144具有更强的抑制GFAP、p-Smad2和CTGF表达的能力，IC50值（10.08 μM）较P144（56.63 μM）降低5.6倍。通过Flag标签和LAMP1共定位实验证实了EndoP144的溶酶体转运特性，si-Igf2r敲低实验和巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1, BAF）实验验证了其IGF2R依赖性和溶酶体依赖性降解机制。体内实验进一步证实了EndoP144与IGF2R的特异性结合以及Enp-MGelMA水凝胶对TGF-β的时序调控作用，在急性期（1-3 dpi）保留TGF-β的抗炎和神经保护作用，在亚急性期显著抑制过度表达的TGF-β。在b-SFN@Hybrid-Exo的构建与功能验证方面，研究人员成功制备了粒径约158 nm的Hybrid-Exo，siRNA包封效率约84-85%，且显著提高了siRNA的血清稳定性。体外实验证实Hybrid-Exo保留了M2外泌体的抗炎活性，能够下调iNOS并上调Arg-1表达，同时通过沉默Notch1及其下游Hes1、Hey1基因有效促进NSC的神经元分化（Tuj1阳性细胞增加、GFAP阳性细胞减少）。FTIR光谱证实了吡唑啉酮苯甲酸在丝素蛋白纳米颗粒表面的成功修饰，b-SFN@Hybrid-Exo复合物在72小时内的外泌体保留率（63.38%）显著高于游离Hybrid-Exo组（35.08%）和未修饰SFN组（46.8%），且释放物在14天后仍保持免疫调节活性。在体外功能验证方面，EnpMG-bSH水凝胶表现出良好的细胞相容性，不增加cleaved caspase-3表达和细胞凋亡比例，同时降低Nestin和SOX2表达启动分化。Transwell共培养实验证实EnpMG-bSH显著促进NSC向Tuj1阳性神经元分化并减少GFAP阳性星形胶质细胞，同时有效抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞M1极化并促进M2表型转化。在体内移植实验方面，LV-EGFP标记的NSC移植后，EnpMG-bSH@NSC组在7 dpi和28 dpi均表现出更大的EGFP阳性面积、更低的cleaved caspase-3表达和凋亡比例，NeuN阳性细胞比例显著增加而GFAP阳性细胞比例显著降低，表明该水凝胶微环境有利于移植NSC的存活、持续保留和神经元分化。突触标记物SYN和PSD-95表达显著增加，运动诱发电位（MEP）记录显示峰值振幅显著增大、起始潜伏期缩短，证实了移植物相关的突触重塑和功能神经修复。
研究结论表明，该EnpMG-bSH@NSC复合水凝胶系统通过AI辅助设计的EndoP144实现TGF-β的靶向降解和胶质瘢痕形成的时序调控，通过Hybrid-Exo实现Notch1基因沉默和M2抗炎微环境重塑，通过b-SFN实现外泌体的长效缓释，三者协同作用有效改善了SCI后的病理微环境，促进了移植NSC的存活、神经元分化和突触形成，最终恢复了运动通路的电生理传导功能。该研究建立了多靶点协调干预的设计框架，为SCI及其他中枢神经系统疾病的治疗提供了新的策略和理论基础。
