环境背景决定鲍曼不动杆菌Tol-Pal系统对细胞被膜完整性的生理贡献

《Journal of Bacteriology》：Environmental context defines the physiological contribution of the Tol-Pal system to cell envelope integrity in Acinetobacter baumannii

　　

革兰氏阴性菌的细胞被膜需要在生长和分裂过程中协调重塑肽聚糖（peptidoglycan，PG）层和外膜（outer membrane，OM），以维持被膜完整性。保守的Tol-Pal系统有助于被膜的维持，但其缺失的生理后果因环境背景和革兰氏阴性菌种类而异。在此，研究人员在鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）中考察了Tol-Pal在不同生长环境中的贡献。Tol-Pal缺失并未导致显著的群体生长缺陷，且在标准实验室条件下，间隔肽聚糖的掺入基本保持正常。相反，在营养丰富的培养基、改变渗透平衡的条件以及宿主类似环境中，细胞分裂组织和细胞形态出现缺陷。Tol-Pal缺陷细胞还表现出外膜屏障稳健性的轻度但可重复的降低，而破坏Mla磷脂转运系统则进一步加剧了这些缺陷。与这些表型一致，Tol-Pal缺失降低了细菌在环境胁迫和宿主相关模型中的适应度。总之，这些发现表明，Tol-Pal有助于外膜屏障稳健性，并且其缺失的额外后果在挑战细胞被膜的条件下变得明显。破坏保守被膜系统的生理后果可随细菌生长的条件而变化。在鲍曼不动杆菌中，Tol-Pal缺失在常规实验室条件下对群体生长影响很小，但会轻度损害外膜屏障稳健性；而特定的环境和宿主相关条件则暴露出细胞分裂组织和细菌适应度方面的额外缺陷。这些发现突显了环境背景如何塑造Tol-Pal缺陷的生理后果，并为理解为什么这一保守被膜系统在不同革兰氏阴性菌中的贡献存在差异提供了框架。

革兰氏阴性菌的细胞被膜由内膜（inner membrane，IM）、肽聚糖（peptidoglycan，PG）层和外膜（outer membrane，OM）构成，其完整性依赖于生长和分裂过程中各层间的协调重塑。Tol-Pal系统是一个保守的跨被膜复合物，由内膜蛋白TolQ、TolR、TolA、周质蛋白TolB和外膜脂蛋白Pal组成，通过质子动力驱动，参与细胞分裂时隔膜处外膜内陷和膜完整性维持。然而，Tol-Pal缺失的生理后果在不同细菌种类和生长条件下差异显著。鲍曼不动杆菌是一种机会致病菌，可在医院环境和宿主组织等多种生态位存活，面临渗透压、营养波动、干燥和宿主胁迫等挑战，是研究环境背景如何塑造保守被膜系统功能的理想模型。当前问题在于：Tol-Pal系统在鲍曼不动杆菌中的具体生理贡献是什么？其缺失在何种环境下才明显？为什么该系统的贡献在革兰氏阴性菌中存在差异？为此，研究人员开展了本研究。

研究人员在实验室菌株ATCC 17978和临床分离株AB5075中系统分析了Tol-Pal缺失的后果。他们发现，在标准实验室条件下，Tol-Pal缺失几乎不影响群体生长，隔膜肽聚糖掺入也基本正常；但在富营养培养基、渗透压改变条件和宿主模拟环境中，出现细胞分裂组织紊乱和形态缺陷。此外，Tol-Pal缺失轻度但可重复地削弱外膜屏障稳健性，破坏Mla磷脂转运系统会加剧该缺陷，并导致环境胁迫和宿主模型中的适应度下降。这些结果表明，Tol-Pal的生理贡献高度依赖环境背景，为理解该保守系统在不同革兰氏阴性菌中功能差异提供了框架。

为探究上述问题，研究人员主要采用了以下技术方法：利用RecAb介导的重组工程在ATCC 17978背景构建缺失整个tol-pal位点及ΔtolQRA、ΔtolB-pal的框内突变体，并从Manoil文库获得AB5075转座子插入突变体（覆盖tolQ、tolR、tolA、tolB、pal），通过质粒表达进行基因互补验证；使用荧光D-氨基酸（HADA）标记结合相差/荧光显微术，定量分析细胞长度、宽度、隔膜数和肽聚糖掺入模式；通过斑点稀释实验检测去垢剂和抗生素敏感性；采用³²P标记磷脂结合薄层色谱分析磷脂组成，利用SDS-PAGE分析脂寡糖（lipooligosaccharide，LOS）谱；利用人工尿液培养基（AUM）模拟宿主环境；通过干燥存活、生物膜形成和表面运动实验评估环境适应度；使用蜡螟幼虫感染模型（每组n=25）和小鼠肺炎模型（每组n=5，C57BL/6）评估毒力。

**Tol-Pal缺失允许标准实验室条件下的群体生长**：研究人员通过生长曲线测定发现，在LB、TSB和BHI三种培养基中，Δtol-pal、ΔtolQRA和ΔtolB-pal突变体与野生型的群体增长动力学相当；AB5075背景的转座子插入突变体也显示类似结果，表明Tol-Pal对标准富营养液体培养中的群体扩增贡献甚微。

**生长环境揭示Tol-Pal缺陷细胞的细胞分裂缺陷**：通过HADA标记和形态定量分析，在LB中突变体形态和隔膜PG掺入与野生型无差异；但在TSB或BHI中，突变体出现明显丝状化、不完全缢缩和多隔膜细胞，PG掺入位点分散，互补实验恢复表型。稀释TSB和BHI可抑制丝状化，提示富营养且浓缩的环境特性促使缺陷显现。

**Tol-Pal缺陷细胞的细胞分裂缺陷对渗透条件敏感**：在无NaCl的LB0N中，突变体呈现丝状化和隔膜PG掺入紊乱；补充蔗糖、琥珀酸钠或MgCl₂、CaCl₂可恢复形态。在含550 mM NaCl的高渗LB中，突变体形成细胞聚集并出现异常PG掺入，且生长延迟。互补实验恢复，说明渗透环境强烈影响Tol-Pal缺失的形态后果。

**Tol-Pal对外膜屏障稳健性有贡献**：在标准LB条件下，突变体对胆汁盐、脱氧胆酸盐、SDS-EDTA、万古霉素、杆菌肽、利福平、多粘菌素B和粘菌素的敏感性高于野生型；AB5075突变体对SDS-EDTA和粘菌素也显示敏感性增加。Δtol-pal Δmla双突变体比任一单突变体更敏感。总磷脂组成（磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰甘油PGL、心磷脂CL）和LOS谱在突变体中未见明显改变。

**Tol-Pal支持环境和宿主相关条件下的细菌适应度**：干燥条件下突变体存活率降低；生物膜形成和表面运动能力减弱；在蜡螟幼虫模型中，突变体的宿主存活率差异未达统计学显著；在小鼠肺炎模型中，AB5075的tolA::tn和pal::tn突变体毒力显著降低；在AUM中，突变体形态和隔膜组织异常，但群体生长正常。

研究人员指出，Tol-Pal缺失并不阻断隔膜PG掺入，而是破坏其空间组织，说明Tol-Pal的作用是协调被膜重塑而非直接控制PG合成。渗透条件不能完全解释条件性缺陷；富营养、低渗和高渗等不同环境均能影响表型，说明环境背景是综合决定因素。外膜屏障的轻度缺陷可能使细胞在额外胁迫下更脆弱；总磷脂和LOS组成无大幅变化，但Mla系统破坏会加剧屏障缺陷，提示多种被膜维持途径共同保护外膜。研究结论为：Tol-Pal在标准实验室条件下有助于外膜屏障稳健性，并在特定环境条件下调节与包膜应激相关的额外表型；该研究提供了理解Tol-Pal贡献在不同革兰氏阴性菌中存在差异的生理框架，并强调环境背景是决定保守被膜维持系统生理重要性的关键因素。