## 中文标题 五种分子检测方法检测Strongyloides spp.的比较研究：qPCR与LAMP的物种特异性差异及诊断不一致性评估

《Journal of Clinical Microbiology》：Five ways to find a parasite: comparison of five molecular assays for the detection of Strongyloides spp.

类圆线虫病（strongyloidiasis）由Strongyloides属线虫引起，是一种被忽视的热带病，具有重要的公共卫生影响。准确的诊断对于疾病监测和控制至关重要，然而传统的粪便检查方法和血清学方法在敏感性和特异性方面存在局限性。分子检测提供了一种替代诊断方法。在本研究中，研究人员使用来自加蓬和巴布亚新几内亚的人类粪便DNA样本（其中同时包含Stecoralis（Strongyloides stercoralis）和S. fuelleborni（Strongyloides fuelleborni）感染）比较了四种基于探针的实时荧光定量PCR（real-time PCR，qPCR）检测方法和一种环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）检测方法。研究结果显示不同检测方法之间存在不一致性，没有任何单一引物组能在所有检测方法中识别所有阳性样本。一种检测方法被确定仅对S. stercoralis具有特异性，而其他检测方法会扩增其他Strongyloides spp.。这可能影响分子诊断在流行病学调查中的特异性，特别是在亚洲和新几内亚的人类S. fuelleborni感染被越来越多地识别的情况下。在所检查的检测方法中，四种是基于探针的qPCR检测方法，一种是LAMP检测方法。对阳性扩增子进行测序后，为两种检测方法鉴定出了肠道细菌序列。然而，随后的测试和BLAST结果确定，按照检测方法设计的那样包含探针可增加特异性，因此细菌序列不会被扩增。这些发现为解释各种Strongyloides分子检测方法的结果提供了背景。

## 论文解读文章

### 研究背景与目的

类圆线虫病是由Strongyloides属线虫引起的一种潜在致命的寄生虫病，全球估计约有6.14亿人感染。世界卫生组织（WHO）于2020年将其认定为土壤传播蠕虫病（STH），但常用的Kato Katz（KK）显微镜技术无法有效检测Stecoralis（Strongyloides stercoralis），导致该病在国家控制规划和大规模药物给药（MDA）活动中长期被忽视。此外，Strongyloides fuelleborni是一种主要感染非洲和亚洲非人灵长类的人畜共患物种，其虫卵在粪便中排出，形态上与钩虫卵相似，容易造成显微镜误诊。近年分子分析提示亚洲与非洲的S. fuellebori支系可能代表不同物种，且已有研究发现人类感染另一种与猪源S. ransomi密切相关的未描述Strongyloides物种。

准确的诊断对疾病负担评估、流行病学研究和临床个体诊疗至关重要。分子检测方法，尤其是实时荧光定量PCR（qPCR）和环介导等温扩增（LAMP），在敏感性上优于传统显微镜检查，并可用于保存样本的批量检测。然而，不同分子检测方法的分析敏感性、特异性、靶序列拷贝数、物种或基因型覆盖范围及对粪便中抑制剂的耐受性各不相同。目前仅少数Strongyloides分子检测方法经过临床诊断验证，多数仍用于研究或流行病学场景，且各检测方法在不同流行环境中的性能和物种特异性缺乏系统性比较。因此，本研究选取四个基于探针的qPCR检测方法和一个LAMP检测方法，直接比较其对人类粪便样本中S. stercoralis和S. fuelleborni的相对敏感性和特异性。

### 主要技术方法

研究人员使用了来自加蓬（2023年Ngounie省七村庄，241份粪便样本，70%乙醇和10%福尔马林保存）和巴布亚新几内亚（2018–2019年东部高地省纵向研究，196份粪便样本，-80°C冷冻）的粪便DNA样本。加蓬样本采用PowerSoil Pro kit提取DNA，PNG样本采用QIAamp DNA Mini Kit提取。所有样本分别接受Llewellyn、Verweij、Pilotte、Chankongsin四种探针qPCR检测及Watts LAMP检测，并设置阳性对照、标准曲线和无模板对照（NTC）。阳性扩增子经Sanger测序和BLAST比对，另以引物BLAST评估脱靶扩增；统计方法包括计算阳性百分比一致性（PPA）、阴性百分比一致性（NPA）、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）及Cohen’s kappa一致性。

### 研究结果

**患病率**
在加蓬队列中，Verweij qPCR检出率最高（15.8%；95%CI 14.4–24.5），其次为Chankongsin和Llewellyn（各7.5%）。在PNG队列中，Chankongsin qPCR检出率最高（9.9%；95%CI 5.7–13.9），其次为Llewellyn（8.4%）和Verweij（6.9%）。显微镜检查在加蓬仅检出5份阳性（2.07%），其中4份形态学鉴定为S. fuelleborni，1份为S. stercoralis；一份显微镜阳性样本未被任何分子检测检出，且没有样本被所有四种qPCR同时检出。

**方法比较**
五种分子检测在PNG样本中的总体一致性优于加蓬样本。加蓬样本中有16份仅Verweij检测阳性，8份仅Llewellyn检测阳性，7份仅Pilotte检测阳性；PNG队列中仅Pilotte、Llewellyn和Chankongsin各自有3–4份样本单独阳性。阳性样本的平均循环阈值（C_t）为24–39，加蓬样本中Verweij检测的C_t值低于其他检测。

**Kappa一致性**
五种检测方法之间的总体一致性较低，但加蓬和PNG合并分析时，Chankongsin qPCR与Watts LAMP之间以及Verweij与Chankongsin qPCR之间观察到实质性一致性。

**PPA、NPA、PPV和NPV**
所有检测方法的总体NPA均高于90%；Pilotte qPCR的PPA在两种参考标准和两个队列中均为最低。以所有阳性检测为复合标准时，加蓬队列中Verweij的PPA最高，PNG队列中Chankongsin的PPA最高。Pilotte、Llewellyn和Verweij的PPV总体较低，而所有检测的NPV均高于80%。

**测序**
Verweij和Chankongsin qPCR的测序成功率较低；在没有探针特异性限制的情况下，两者从加蓬样本中扩增出肠道细菌序列（Segatella copri、Anaerostipes hadrus、Mediterraneibacter gnavus和Escherichia coli）。Pilotte qPCR仅扩增S. stercoralis，且未检出任何S. fuelleborni阳性样本。值得注意的是，PNG队列中一份Pilotte阳性样本经Llewellyn检测测序，与猪源性S. ransomi有100%序列一致性。Watts LAMP对S. stercoralis和S. fuelleborni均产生阳性结果，但测序显示其可匹配多种Strongyloides spp.（包括S. ratti、S. ransomi、S. procyonis等）。

**脱靶扩增**
Chankongsin阳性样本的SYBR Green检测和常规PCR均显示单一熔解峰和单一目的条带。当使用细菌DNA作为模板时，仅Chankongsin引物在SYBR Green格式下扩增了M. gnavus DNA，但Taqman探针检测可消除该非特异性扩增。

**引物核苷酸BLAST**
所有检测的引物和探针与S. copri、A. hadrus和M. gnavus的脱靶相似性极小（e值较低），而Pilotte检测仅获得S. stercoralis序列，Chankongsin引物的前100个BLAST命中均属于Strongyloides属。

### 讨论与结论

研究结果显示，不同分子检测方法之间的一致性较差，尤其在加蓬队列中；这可能与样本保存方式（70%乙醇固定）、DNA提取方法、地理人群差异和Strongyloides基因型差异有关。测序失败主要归因于短扩增子（92–138 bp）不适合Sanger测序，而扩增子较长的Llewellyn和LAMP检测测序成功率更高。Pilotte检测对S. stercoralis具有高度物种特异性，但无法检测S. fuelleborni，后者的感染在亚洲和新几内亚的人类中日益多见，因此使用该检测可能低估或错判物种分布。其他检测尽管可同时扩增两种线虫，但存在物种间交叉扩增，导致S. fuelleborni感染可能被误报为S. stercoralis。此外，在PNG婴儿样本中发现的S. ransomi样序列提示可能存在新型人畜共患Strongyloides物种。血清学检测存在交叉反应和无法区分现症与既往感染等局限，分子检测则具有可批量检测、不受样本运输限制等优势，但必须了解其物种特异性并开展区域性验证。

**结论**：这项对加蓬和巴布亚新几内亚样本进行的五种Strongyloides分子检测比较评估，揭示了检测结果和物种特异性在地区间的显著差异。大多数检测方法对S. stercoralis、S. fuelleborni和S. ransomi样分离株的检出一致性有限，凸显了在多种Strongyloides物种共循环环境下分子诊断的复杂性。这些发现强调了在不同流行环境中验证检测方法的重要性，以及在解读个体诊断和监测控制项目结果时需要对检测特异性保持警惕。