《Biosensors and Bioelectronics》：Unified hybrid RNA-regulated CRISPR diagnostic for concurrent
Mycobacterium tuberculosis detection and rifampicin resistance profiling
编辑推荐：
•通过两种uLsRNA实现"二对四"混合CRISPR逻辑，解锁四个被LsRNA锁定的Cas12a•在一管中同时实现结核分枝杆菌（MTB）检测和多种rpoB突变分析。•达到高灵敏度、高特异性和高分辨率，与Sanger测序一致性达100%。•为同步多位点分析提供灵活、可编程的通用
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通过两种uLsRNA实现"二对四"混合CRISPR逻辑，解锁四个被LsRNA锁定的Cas12a
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在一管中同时实现结核分枝杆菌（MTB）检测和多种rpoB突变分析。
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达到高灵敏度、高特异性和高分辨率，与Sanger测序一致性达100%。
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为同步多位点分析提供灵活、可编程的通用策略。
引言
在分子诊断领域，快速、多重、高保真的核酸检测对于遗传变异分析和病原体鉴定具有迫切需求（He et al., 2023; Kohabir et al., 2025）。规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白12a（CRISPR-Cas12a）凭借其易于编程、等温兼容和强效核酸酶活性，已成为一种强大的生物识别元件，在下一代即时检测中展现出巨大潜力（Lin et al., 2025; Xie et al., 2026）。然而，大多数基于Cas12a的诊断方法依赖于靶标识别后的非特异性反式切割活性来产生信号。这种策略在多突变检测中面临三个固有障碍：(i) PAM序列约束限制了靶位点的灵活选择（Collias and Beisel, 2021; Kohabir et al., 2025; Yang et al., 2024）；(ii) 顺式切割降解扩增底物，降低灵敏度，而共用报告分子导致信号串扰，阻碍了单管多重检测的实现（Yang et al., 2025; Yin et al., 2026）；(iii) 常规反式切割对错配容忍度高，影响单核苷酸分辨能力，增加了近缘变异假阳性的风险（He et al., 2023; Kohabir et al., 2024; Xie et al., 2026）。这些缺陷共同阻碍了传统Cas12a诊断技术实现高覆盖度、一管式多靶标突变分析。
这些局限性在结核病（TB）领域尤为突出。结核病由结核分枝杆菌（MTB）引起，是全球主要传染病威胁之一，2024年估计新发病例达1070万例，其中约39万例为多药耐药/利福平耐药（MDR/RR-TB），约占全球结核病负担的3.6%（World Health Organization, 2025）。利福平（RIF）耐药性是下游药敏试验（DST）的切入点，主要由rpoB基因81 bp利福平耐药决定区（RRDR）内聚集的单核苷酸变异（SNVs）引起，尤其在密码子511、516、526和531位（Farhat et al., 2024; Guo et al., 2021; Ma et al., 2021）。常规诊断方法包括抗酸染色显微镜检查、结核菌培养和基于PCR的检测（如Xpert MTB/RIF）以及全基因组测序，均受限于灵敏度不足、周转时间长、仪器成本高或通量有限等问题，凸显了对可部署分子诊断技术的迫切需求（Kay et al., 2024; Liu et al., 2022; Zifodyy et al., 2021）。
迄今为止，多种基于CRISPR的平台（如SHERLOCK、DETECTR、HOLMESv2、TRACE和SUREST等）（Chen et al., 2018; Gootenberg et al., 2017; Huang et al., 2025; Li et al., 2019; Sam et al., 2021; Wu et al., 2025）以及结核特异性适配方案（如SHINE-TB和TB-QUICK）已展现出诊断前景（Bell et al., 2025; Sam et al., 2021），通常将Cas12/13切割与预扩增结合以实现高灵敏度。然而，它们仍然受到上述障碍的困扰：依赖PAM的靶向具有偶然性和不可靠性（Kohabir et al., 2025; Ning et al., 2022）；共用报告分子阻碍了对多个rpoB密码子的单管检测；提高特异性的策略（人工错配、间隔序列截短、化学修饰）依赖于特定序列，需要逐例繁琐优化，阻碍了多重检测的推广（Kohabir et al., 2025）。具有正交底物的双Cas系统可实现双检测，但不足以支持更高级别的多重分析（Ding et al., 2025）。间隔序列介导的识别在原理上可实现通用的SNV分辨，但其rpoB应用仍受限于PAM、多重化和特异性等约束。因此，迫切需要一个可编程的CRISPR诊断平台，以克服上述局限，同时实现MTB检测和RIF耐药分析。
在本工作中，我们介绍了TB-SCANER（结核筛查CRISPR-Cas12aAssay for Numerous Established RIF-resistant mutations），即针对多个已确立的RIF耐药突变的TB筛查CRISPR-Cas12a检测法），这是一种可编程的串联混合调控平台，可在单一反应中依次解锁四个被LsRNA（锁定单链RNA）阻断的CRISPR/Cas12a系统（Ls-CRISPR）。我们的方法不依赖于无靶标的反式切割，而是通过协调的"一对一"和"一对三"解锁模式，利用时序控制的顺式切割来实现。双链RPA结合T7转录产生两类解锁单链RNA（uLsRNA），分别来源于MTB特异性的mpb64基因（M通道）和三个rpoB RRDR区域（R1-R3通道，覆盖密码子511/516、522/526和531/533），从而实现MTB感染的同步检测和RIF耐药分析。
章节摘要
TB-SCANER平台机制概述
我们开发了TB-SCANER平台，这是一种混合策略，其中Cas12a被与crRNA间隔序列杂交的LsRNA可逆性地阻断，并通过靶标特异性的uLsRNA重新激活。通过一对一配置靶向mpb64基因（M通道），通过一对三配置靶向rpoB RRDR热点区域（R1-R3通道），我们结合RPA和T7转录产生uLsRNA（图1和图S1）。借助PR-Act，一种工程化的双链DNA（dsDNA），具有标准PAM位点（TTTC），作为……
结论
TB-SCANER的开发旨在解决结核病诊断中的两个并行挑战：对MTB进行灵敏、特异检测的需求，以及全面分析散布在多个rpoB RRDR密码子（511、516、522、526、531和533）上、具有不同替代类型的RIF耐药突变的困难——常规单管检测方法无法充分覆盖这些突变。该平台通过一对一（mpb64）调控模块应对第一个挑战，用于MTB检测，并通过……
CRediT作者贡献声明
李士俊：监督指导、资源、项目管理、资金获取。胡前方：资源、数据管理。黄俊飞：资源、数据管理。陈亿江：资源、数据管理。谢亚星：方法学。杨晓兰：撰写——审阅与编辑、监督指导、资源、项目管理、方法学、资金获取、形式分析、概念构思。曾晓燕：方法学、形式分析。祁国荣：方法学。王姜飞：验证、调查。
利益冲突声明
作者声明，不存在可能影响本文所报告工作的已知财务利益或个人关系方面的竞争利益。
伦理审批
本研究已获得贵州省疾病预防控制中心人类伦理委员会批准（伦理审批号：S2023-02），并符合《赫尔辛基宣言》。
利益冲突声明
? 作者声明，不存在可能影响本文所报告工作的已知财务利益或个人关系方面的竞争利益。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：82273900和82460659）、重庆市自然科学基金（编号：CSTB2023NSCQ-MSX0994）、重庆市渝中区科技计划项目（编号：20210132）、中国公共卫生人才培育项目（国疾控总人函〔2024〕122号）、贵州省微生物与传染病防控重点实验室（编号：黔科合平台人才-ZDSYS）……
杨兴桂|曾晓燕|祁国荣|王姜飞|魏晓宇|胡前方|黄俊飞|陈亿江|谢亚星|李颖|钟宇婷|李士俊|杨晓兰
