一种基于TDN界面和UiO-66-NH2纳米载体的Ago介导的双链生物传感平台，该平台利用正交电化学编码技术实现microRNA的检测

《Biosensors and Bioelectronics》：An Ago-mediated duplex biosensing platform with orthogonal electrochemical coding for microRNA detection based on TDN interfaces and UiO-66-NH 2 nanocarriers

　　

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  一种可编程的Argonaute平台能够实现微RNA的双倍电化学检测。
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  指数级扩增可以生成用于序列特异性双倍检测的引导序列。
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  亚甲蓝和L-012可以实现两个微RNA通道的独立检测。
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  该检测方法可以分别检测到浓度为1.85 aM的miR-21和0.51 aM的miR-92a。
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  八个伏安特性可以区分40个血清样本，其曲线下面积为0.94。

引言

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，也是癌症死亡的第二大原因（Bray等人，2024年；美国预防服务工作组，2021年）。现有的筛查方法受到侵入性、准备负担或对早期病灶敏感性较低的限制（van der Meulen等人，2016年），而静态活检无法支持肿瘤异质性的动态评估（van der Meulen等人，2016年；Wan等人，2017年；Zhou等人，2022年）。循环微RNA（miRNA）提供了一种非侵入性的液体活检方法（Wan等人，2017年；Zhou等人，2022年）。一项荟萃分析确定了miR-21和miR-92a是多项研究中报告的与CRC相关的循环miRNA（Carter等人，2017年），而一项临床血清研究进一步表明这两种miRNA在CRC患者中显著上调，并支持它们的联合检测（Liu等人，2013年）。级联等温扩增结合G-四链分子信标也实现了miR-21、miR-92a和miR-31的多重检测，证明了这些与CRC相关的miRNA一起检测的可行性（Chen等人，2020年）。

由于循环miRNA的长度较短且丰度较低，因此难以测量。定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）和测序方法虽然灵敏，但需要复杂的仪器。指数级扩增反应（EXPAR）可以对短核酸目标进行等温扩增（Jia等人，2010年），并且与电化学读数兼容。可编程核酸酶可以实现灵敏的核酸分析，CRISPR-Cas系统也支持电化学miRNA检测（Chen等人，2018年；Gootenberg等人，2017年；Li等人，2024年）。CRISPR-Cas系统使用crRNA来识别DNA或RNA目标，目标位点的选择可能受到效应子依赖的PAM或PFS要求的限制。目标识别可以激活序列无关的报道分子切割，从而实现高效的信号放大（Santiago-Frangos等人，2022年）。相比之下，pAgos通常使用短的gDNA通过碱基配对在引导定义的位置进行序列特异性切割，从而实现灵活的目标位点设计。它们的DNA引导序列易于合成、稳定且易于调整，而多轮次的pAgo活性可以进一步放大信号（Li等人，2023年）。对于多重检测，序列无关的CRISPR-Cas切割通常需要正交的Cas效应子、不同的报道系统或空间分离来区分目标（Yang等人，2023年）。通过改变gDNA序列，单个pAgo可以重新定向到多个目标，从而实现多重检测（Li等人，2025c）。Ago电化学检测目前主要限于单一目标（Mao等人，2025年；Yang等人，2025年）。双倍检测还需要具有不同电位的报道分子。亚甲蓝（MB）是一种成熟的电化学报告分子（Batchelor等人，2025年），而L-012主要用于化学发光和电化学发光（Choi等人，2026年；Djoumer等人，2026年；Han等人，2025年；Hiramoto等人，2021年；Wang等人，2020年），在本研究中显示其在差分脉冲伏安（DPV）下的峰值与MB大约相差0.8 V。矩阵效应进一步限制了单电流读数的准确性。电化学曲线特征提高了葡萄糖检测的准确性（Zhang等人，2024年），而电化学指纹技术实现了复杂样本的分类（Tan等人，2025年）。这些报告支持对复杂信号的多变量解释（Bocan等人，2025年；Giordano等人，2023年；Li等人，2025a，2025b；Tan等人，2025年；Zhang等人，2024年）。

在这里，我们开发了基于Ago介导的双重正交读数微RNA电化学检测（ADORE）平台，用于检测与CRC相关的miR-21和miR-92a。该平台将正交的MB/L-012编码与带有负载有报告分子的UiO-66-NH₂纳米载体的四面体DNA纳米结构（TDN）接口结合起来。刚性的DNA骨架提供了明确的探针呈现方式，而多孔载体则集中了电化学报告分子。EXPAR生成gDNA，这些gDNA可以编程Clostridium butyricum的Argonaute（CbAgo）进行序列特异性界面切割，分离的报告分子电位允许独立分配两种响应。我们评估了材料组装、扩增、电化学性能、特异性和血清回收率。最后，通过支持向量机（SVM）整合了两个DPV通道的八个特征，对20名CRC患者和20名健康对照者的血清样本进行了分类。

章节片段

材料与方法

有关试剂、实验程序、仪器参数、计算设置和数据处理的详细信息，请参见支持信息。

ADORE平台的设计和检测原理

图1总结了ADORE的工作流程。检测接口包含编码有UiO-66-NH₂@MB和UiO-66-NH₂@L-02的TDN支架，为miR-21和miR-92a提供独立的DPV通道。刚性的TDN支架定义了切割底物的呈现方式，而UiO-66-NH₂将报告分子集中在电极附近，并将纳米探针的释放转化为可测量的电流损失。每个目标都会启动EXPAR，生成用于CbAgo进行序列特异性切割的gDNA

结论

ADORE结合了EXPAR-CbAgo切割、正交的MB/L-012编码以及TDN/UiO-66-NH₂接口，用于检测miR-21和miR-92a。该平台实现了miR-21的LOD为1.85 aM，miR-92a的LOD为0.51 aM，同时保持了两种报告分子的独立读数。在40个血清样本的队列中，来自两个通道的ΔI、A_h、E_p和FWHM的融合产生了0.94的交叉验证诊断AUC，这高于任一miRNA通道单独的AUC。通过连接可编程的Ago

CRediT作者贡献声明

Hanxue Li：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，验证，方法学，数据管理。Kexin Wu：撰写——初稿，可视化，方法学，数据管理。Hanhua Li：方法学，数据管理。Jilie Kong：资金获取，概念构思。Hui Chen：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金（编号22274028、22127806和22174022）和上海自然科学基金（编号24ZR1459800）的共同支持。

Hanxue Li|Kexin Wu|Hanhua Li|Jilie Kong|Hui Chen