一种基于PfAgo辅助的人工核酸回路用于乳制品中金黄色葡萄球菌的免提取超高灵敏检测

《Biosensors and Bioelectronics》：A PfAgo-assisted artificial nucleic acid circuit for extraction-free and ultrasensitive detection of Staphylococcus aureus in dairy products

　　

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  PfAgo 辅助的人工核酸回路实现了金黄色葡萄球菌的一步法检测。
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  该检测方法在 95 °C 下在单一试管中整合了细菌裂解和信号扩增。
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  无需 DNA 提取，PfAgo-ANCA 实现了 10⁰ CFU/mL 的检测限。
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  该平台对常见乳品相关细菌表现出高特异性。
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  通过重新设计 gDNA，PfAgo-ANCA 实现了快速且灵活的病原菌检测。

引言

食源性疾病是由摄入受污染食品中的有毒或有害生物体及其他致病因子引起的。它们是全球疾病负担的主要原因之一，仍然是威胁人类健康的重大公共卫生问题 (Li et al., 2024)。在各种食源病原菌中，金黄色葡萄球菌被认为是最令人担忧的微生物之一，并在广泛的食品产品，特别是乳制品中频繁被检出 (Gunjan et al., 2023; Pinamonti et al., 2025)。一旦进入乳品基质，金黄色葡萄球菌不仅能够存活，而且在有利条件下还能产生耐热肠毒素。尽管常规巴氏消毒工艺可以有效消除活菌，但它们不足以去除预形成的毒素，从而对消费者构成持续的食物中毒风险 (Rios-Delgado and Boyd, 2026)。

nuc 基因编码耐热核酸酶，被认为是金黄色葡萄球菌的重要毒力相关因子。该核酸酶通过降解胞外核酸、破坏宿主免疫屏障并促进细菌入侵来促成细菌致病性 (Park et al., 2017)。重要的是，nuc 基因在金黄色葡萄球菌菌株中广泛分布，同时表现出高度的种特异性，使其成为可靠鉴定金黄色葡萄球菌的合适遗传标记。因此，nuc 基因已被广泛用作金黄色葡萄球菌检测和鉴定的可靠分子靶标 (Liu et al., 2026; Dai et al., 2021; Ziegler et al., 2019)。

目前，乳制品中金黄色葡萄球菌的检测主要依赖于常规培养法、免疫学检测和基于聚合酶链反应 (PCR) 的技术 (Amando et al., 2023; Lee et al., 2023)。然而，当应用于复杂乳品基质时，这些方法表现出几种局限性。尽管标准培养法被认为是“金标准”，但它需要劳动密集型的程序，并且通常需要 3–5 天才能获得结果，这与乳制品的短保质期和快速分销要求不兼容 (Szaleniec et al., 2019, 2021)。免疫学方法提供了操作简便性；然而，乳品样品中丰富的酪蛋白和乳脂会引起抗体的非特异性吸附，导致假阳性信号或降低检测灵敏度 (Haiping et al., 2021)。基于 PCR 的方法提供了高灵敏度和快速分析，但乳品基质中残留的 Ca²⁺ 离子、脂质和蛋白质降解产物会显著抑制 Taq 聚合酶活性。此外，复杂的样品预处理程序不可避免地导致核酸损失，而开管操作增加了气溶胶污染的风险，限制了它们在分散式和现场测试场景中的实际应用 (He and Chen, 2010; Law et al., 2015; Wang and Mustapha, 2010)。因此，开发一种对乳品基质干扰耐受性强、操作简单、灵敏度高且特异性优异的新型检测技术，仍然是食品安全监测的迫切需求 (Gehring and Tu, 2011)。

近年来，原核生物 Argonaute (pAgo) 蛋白因其独特的核酸切割特性而在分子诊断领域受到越来越多的关注 (L. Liu et al., 2026)。其中，源自Pyrococcus furiosus (暴热佛氏菌) 的 Argonaute 蛋白 (PfAgo) 展现了特别令人前景的潜力。PfAgo 是一种 DNA 引导的 DNA 核酸内切酶，它利用短的 DNA 引导物在条件下特异性识别和切割与引导链互补的靶 DNA 序列 (Jiao et al., 2026; Li et al., 2025)。与广泛研究的基于 CRISPR/Cas 的系统相比，PfAgo 具有几个独特的优势。首先，PfAgo 采用 DNA 而不是 RNA 作为引导分子，提供了增强的化学稳定性、更低的合成成本和更好的抗降解能力 (Han et al., 2026)。其次，PfAgo 的靶标识别独立于原间隔序列邻近基序 (PAM) 序列，允许在靶基因的几乎任何区域进行灵活的引导物设计 (Yang et al., 2025; Kou et al., 2024; Jang et al., 2023)。第三，PfAgo 表现出单核苷酸分辨率鉴别能力，能够准确区分金黄色葡萄球菌和密切相关的葡萄球菌种 (Dong et al., 2026; Wu et al., 2026)。此外，PfAgo 的高温反应特性有利于减少复杂乳品基质中蛋白质和脂质引起的干扰，从而提高杂交严谨性和检测特异性 (Chen et al., 2026) 基于这些独特性质，基于 PfAgo 的技术在病原菌检测和抗菌药物耐药性分析方面展现了相当大的潜力。然而，大多数现有的基于 PfAgo 的检测策略主要依赖 PfAgo 介导的靶标切割进行直接信号产生，而将 PfAgo 介导的靶标识别与独立的信号扩增回路耦合的潜力仍相对未被探索。因此，将 PfAgo 的可编程靶标识别能力与人工核酸回路整合，可能会提供一种独特的检测架构，将特异性靶标切割与下游信号扩增结合起来。

尽管基于 Argonaute 的人工核酸回路最近作为有前景的分子诊断工具出现 (Xiong et al., 2025)，但它们在复杂乳品基质中直接检测食源病原菌的应用仍很大程度上未被探索。更重要的是，PfAgo 介导的靶标识别与下游人工核酸回路的整合提供了一种独特的策略，通过两个功能耦合模块实现靶标识别和信号扩增。在此，我们开发了一种基于 PfAgo 可编程核酸切割活性的人工核酸回路辅助 Argonaute (ANCA) 新型检测策略，用于特异性检测金黄色葡萄球菌 nuc 基因。在本设计中，“人工核酸回路 (ANCA)"特指设计的核酸反应模块，而“级联扩增”描述在该模块内发生的顺序反应过程。PfAgo 介导的靶标切割产生启动下游 ANCA 扩增级联所需的核酸触发物，从而将初始靶标识别事件转化为放大的荧光信号。因此，“信号扩增”用于描述由级联反应引起的可检测荧光信号的整体增强。通过使用无 PAM 序列限制的基于 DNA 的引导探针，提出的 PfAgo-ANCA 平台能够在 40 分钟内实现快速检测。这种模块化设计使提出的平台区别于常规的基于 PfAgo 的检测方法，通过在靶标切割后引入专用的信号扩增层，同时保留 PfAgo 的序列可编程性和靶标特异性。系统地评估了其分析性能，包括灵敏度、特异性以及在模拟乳品样品中的适用性。本研究为食品基质中食源病原菌的快速、准确和简化检测提供了一种有前景的策略。此外，PfAgo-ANCA 架构的模块化提供了多重检测不同遗传标记的潜力，使得能够在单个分析工作流程中获取关于病原菌身份和毒力相关特征的互补信息。

章节摘录

菌株与样品制备

金黄色葡萄球菌 (CICC 10384) 保存在 -80 °C 直至使用。在冰上解冻后，将细菌悬浮液以 1% (v/v) 的接种比例接种到无菌 LB 肉汤中，并在 37 °C 下过夜培养。随后，将 10 μL 细菌培养物划线接种到无菌 LB 琼脂平板上。平板在 37 °C 下倒置培养 24 小时直至形成单个菌落，之后在 4 °C 下短期保存。

人工污染乳品

检测方法原理

在本研究中，开发了一种基于等温荧光的检测平台，用于特异性鉴定金黄色葡萄球菌的种特异性 nuc 基因 (图 1)。PfAgo 是一种 DNA 引导的内切核酸酶，可以特异性识别和切割与引导 DNA (gDNA) 互补的单链 DNA 靶标。提出的平台利用了 PfAgo 的精确切割活性以及产生的含有 5'-磷酸基团的短 DNA 片段的能力

结论

本研究开发了一种基于 PfAgo 辅助的人工核酸回路 (PfAgo-ANCA) 策略的金黄色葡萄球菌快速敏感检测平台，并系统地评估了其分析性能。通过靶向金黄色葡萄球菌的种特异性 nuc 基因，提出的平台整合了 PfAgo 的精确 DNA 切割活性与人工设计的自催化核酸回路，实现了高效的信号扩增和实时荧光

CRediT 作者贡献声明

Ruotong Wang：数据整理。Zhiqiang Xiong：资金获取。Guangqiang Wang：资源。Xinxin Liu：项目管理。Lianzhong Ai：撰写 - 审阅与编辑。

数据可用性

本研究的所有数据均可通过向主要联系人提出合理要求获得。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

本工作由国家自然科学基金委员会 (重点项目，U22A20550)；上海市自然科学基金 (25ZR1402389)；国家自然科学基金 (批准号 32025029,32672933)；上海工程研究中心食品微生物学计划 (19DZ2281100) 资助。

Ruotong Wang|Zhiqiang Xiong|Guangqiang Wang|Xinxin Liu|Lianzhong Ai