单管巢式MGB探针实时PCR检测多房棘球绦虫虫卵的分析性能与初步现场评价

《Parasitologia》：One-Tube Nested MGB Probes Real-Time PCR Assay for Detecting Echinococcus multilocularis Eggs

多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）是一种人兽共患绦虫，可导致人类和动物疾病。其虫卵通过终宿主（definitive hosts）粪便释放到环境中，是人泡型棘球蚴病（alveolar echinococcosis, AE）的直接感染源。因此，对多房棘球绦虫虫卵污染进行灵敏且物种特异性的监测对有效疾病控制至关重要。研究人员使用其先前发表的单管巢式小沟结合剂（minor groove binder, MGB）探针实时聚合酶链反应（real-time PCR）方法，该方法包含针对多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫（E. granulosus）的特异性探针，用于检测多房棘球绦虫虫卵。该检测将用于分析灵敏度的巢式预扩增与用于特异性的MGB探针检测结合于封闭管形式中，与传统两步巢式PCR相比降低了污染风险。与粪检（coproscopy）相比，其能够进行物种特异性鉴定；与传统PCR相比，其在较低测试浓度下提供可检测扩增。结果显示，该检测与所测试的非靶标犬寄生虫无交叉反应，并表现出批内重复性，变异系数（coefficient of variation, CV）低于3%。当使用从虫卵提取的DNA进行测试时，该检测试剂在多种储存条件下保持稳定，包括4 °C长期储存和多次冻融循环。在对101份犬粪样本的初步现场评价中，该检测与传统PCR鉴定出相同的12份阳性样本，且所有12份均经测序确认为多房棘球绦虫。该检测为进一步在流行病学监测中评价提供了实用工具。然而，其诊断敏感性（diagnostic sensitivity）和诊断特异性（diagnostic specificity）需要在更大规模现场研究中进一步评价。

多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）是一种人兽共患绦虫，主要终宿主为野生犬科（如狐狸）和家犬。成虫寄生于犬小肠，每日排出虫卵，污染土壤、水源和植被；虫卵排出后即具感染性，且因较轻可经空气扩散。人误食虫卵后，幼虫主要在肝脏增殖并形成泡型囊肿，导致泡型棘球蚴病（alveolar echinococcosis, AE）；未经治疗时10年死亡率可达94%，潜伏期可长达15年，因此难以将病例与特定感染源或感染因子建立明确联系。控制棘球蚴病的关键在于管理传染源和切断传播途径，准确检测环境中的多房棘球绦虫虫卵污染及犬感染状态，对理解AE流行病学、识别高风险地区和人群、实施针对性干预十分重要。传统尸检复杂耗时，不适合大规模筛查，且只能检测成虫期感染，不能检测早期未成熟虫体或环境虫卵污染。粪基分子检测无创且灵敏度较高，但粪便含蛋白酶、胆盐等聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）抑制剂，其组成受宿主饮食、健康状态和样本储存条件影响，个体差异明显，可降低聚合酶活性并导致假阴性。TaqMan小沟结合剂（minor groove binder, MGB）探针实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）具有快速、灵敏和高特异性，MGB结构可提高探针与靶序列结合稳定性，允许使用更短探针以区分高度同源序列，非荧光淬灭基团（non-fluorescent quencher, NFQ）可降低背景荧光噪声。此前研究人员已建立单管巢式MGB-qPCR检测人血浆细胞游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）用于AE早期诊断，检测灵敏度达1拷贝/反应并具高特异性。本研究将此前建立的平台用于检测犬粪中的多房棘球绦虫虫卵，并加入细粒棘球绦虫特异性探针，开展分析性能评价和初步现场评估。该研究的意义在于为流行区犬粪监测、感染筛查和进一步流行病学监测提供候选实用工具，但其诊断敏感性和特异性仍需更大规模现场研究确认。

关键技术方法包括：以3只雄性Beagle犬（6–8月龄，来自镇江万维实验动物繁殖有限公司，许可证 SCXK (Su) 2023-0006）建立感染模型，每犬口服50 mL原头节（protoscolex）悬液（200,000/mL），感染后40–60天收集含卵粪样；采用150目（100 μm）和250目（63 μm）筛法及离心富集虫卵；以冻融结合商品化基因组DNA提取试剂盒制备DNA；在ABI 7500实时PCR仪上进行单管巢式MGB-qPCR，采用两阶段循环，Ct≤38判为阳性；开展分析特异性、质粒与虫卵梯度灵敏度、批内重复性、4 °C与冻融稳定性及现场样本比较。现场队列为2024–2025年青海西宁（2300 m）、格尔木（2780 m）和西藏那曲（4500 m）的101份犬粪，含11份家犬和90份流浪犬，并与常规PCR及测序比较。

3.1. 实时PCR特异性（Specificity of Real-Time PCR）：通过Em和Eg物种特异性MGB探针检测，Em探针仅检测含多房棘球绦虫序列的DNA，Eg探针仅检测含细粒棘球绦虫序列的DNA，二者无交叉荧光；混合DNA样本中两种探针均产生扩增信号。对犬弓首蛔虫（Toxocara canis）和犬复孔绦虫（Dipylidium caninum）基因组DNA未产生信号，三次独立重复结果一致。该检测靶向多房棘球绦虫线粒体基因组1260 bp片段中115 bp扩增子内的17 bp分析区域，与细粒棘球绦虫对应区域同源性＞99%，通过探针结合位点第8和第15位两个单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs）区分两种棘球绦虫。

3.2. 灵敏度分析结果（Sensitivity Analysis Results）：通过质粒标准品和虫卵梯度评价。PEm和PEg质粒在最低测试浓度即名义单拷贝（nominal single copy）水平可检测到扩增，平均Ct分别为34.2 ± 0.85和33.8 ± 0.79；在10¹–10⁵拷贝范围内，Ct值与初始模板拷贝数对数呈强相关，PEm回归方程为y = ?3.322 log₁₀(x) + 37.17，R² = 0.9943；PEg为y = ?3.224 log₁₀(x) + 34.30，R² = 0.9914。由标准曲线得出的扩增效率略高于常规单阶段qPCR，原文将其归因于巢式预扩增阶段在实时检测前富集靶模板。虫卵梯度中，1–100 eggs/反应范围可检测，单卵水平可产生可检测扩增，平均Ct为34.8 ± 0.92，回归方程为y = ?4.629 log₁₀(x) + 35.30，R² = 0.9906。结果表明该检测在实验室样本中可检测低丰度虫卵，但自然感染样本的现场适用性仍需进一步分析评价。

3.3. 批内重复性（Intra-Assay Repeatability Assay）：通过10 eggs/10 μL和50 eggs/10 μL两个虫卵浓度各独立重复10次评价。低浓度组Ct值范围30.19–31.75，均值30.968，标准差（standard deviation, SD）0.781，变异系数（coefficient of variation, CV）2.5%；高浓度组Ct值范围25.73–26.67，均值26.198，SD 0.467，CV 1.8%。两浓度CV均低于3%，高浓度组CV更低，符合重复性与模板量正相关的预期；20次重复中阴性对照均未检出Ct，背景信号保持阴性。结果说明该法在接近检测限的低载量条件下仍具有稳定定量能力。

3.4. 模拟储存条件下试剂稳定性（Reagent Stability Under Simulated Storage Conditions）：通过将预混PCR反应缓冲液避光储存于4 °C，并在30、60、90天加入50 ng多房棘球绦虫虫卵DNA扩增评价。90天内各时间点扩增曲线高度一致，信号强度衰减小，未观察到试剂降解所致假阴性或扩增延迟。冻融稳定性研究中，预混试剂储存于?20 °C并经受5、10、20次完整冻融循环，加入50 ng虫卵DNA模板后，即使20次循环后扩增效率和检测信号也无明显衰减，阳性判读可重复。原文将稳定性归因于反应体系中的稳定剂、MGB探针3^′端化学修饰、耐热DNA聚合酶和高渗缓冲体系。

3.5. 初步现场评价与一致性评估（Preliminary Field Evaluation and Concordance Assessment）：通过对2024–2025年青海和西藏流行区采集的101份犬粪进行检测。样本来自西宁（2300 m）、格尔木（2780 m）和那曲（4500 m），其中11份来自家犬，90份来自流浪犬；样本采集后于?80 °C储存至少10天以灭活虫卵感染性。实时PCR检测出12份多房棘球绦虫阳性，常规PCR同时鉴定出相同12份阳性，初步现场评价中两法一致。所有12份阳性样本的外侧引物484 bp和内侧引物115 bp扩增子测序均与多房棘球绦虫线粒体参考基因组CBLO020001206.1匹配；VIC通道未出现细粒棘球绦虫信号。11份家犬样本无阳性，12份阳性均来自流浪犬。结果支持该法在?80 °C储存后对现场采集样本具有一致性表现，并支持其用于流行区犬粪流行病学监测和犬感染筛查的潜在用途。

讨论部分总结了多房棘球绦虫生命周期依赖终宿主犬科和中间宿主啮齿类之间的传播循环。成虫每日释放数千虫卵并经粪排出，虫卵在外环境存活能力强，可保持感染性数月至一年。人作为意外宿主误食虫卵后，六钩蚴孵化、穿透肠壁、进入血流，最终主要在肝脏积聚并引起AE。传统尸检结合光学显微镜虽可靠性较高，但区分不同绦虫种类能力有限；多种带绦虫虫卵形态高度相似，仅凭形态准确鉴别困难且易误判。酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）适合大规模筛查，但抗原交叉反应易致假阳性，特异性不足限制其在流行病学调查中的可靠性。分子工具已越来越多用于犬和家畜寄生虫流行病学监测。Knapp et al.建立MLX qPCR，可同时检测四种致病棘球属，并在81份AE和囊型棘球蚴病患者手术标本中验证，特异性达100%。Hifumi et al.采用RPA建立检测马肝结节中多房棘球绦虫的快速方法，与PCR结果一致性94.4%，且比PCR敏感100倍。本研究应用先前建立的单管巢式MGB-qPCR平台并加入细粒棘球绦虫特异性探针，检测犬粪中多房棘球绦虫虫卵，未观察到与所测试非靶标寄生虫交叉反应，并显示批内重复性和试剂稳定性。MGB探针可区分高度同源序列，该法通过两个SNPs区分多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫，有助于防止假阳性。稳定性测试中，预混PCR试剂4 °C储存90天或?20 °C经受20次冻融后Ct值无显著偏差。现场评价中，家犬无阳性，12份阳性均来自流浪犬；原文指出这可能反映国家棘球蚴病防控项目对犬驱虫、监测和公众健康教育的效果，也提示流浪犬管理可能存在缺口。局限性包括：因参考材料有限，未对犬带绦虫如Taenia hydatigena、T. multiceps和Mesocestoides spp.进行特异性实验；现场评价仅101份犬粪，且仅与常规PCR一致不足以建立诊断敏感性或特异性；未设内部扩增对照（internal amplification control, IAC），无法区分真阴性与粪便DNA提取物中PCR抑制剂导致的假阴性；单拷贝和单卵敏感性分别在质粒标准品和人工挑选虫卵的受控条件下确定，可能不能反映复杂粪基质中低虫卵数检测；现场评价仅限犬粪，土壤和水等环境样本尚未测试；筛法和离心过程中虫卵回收效率未定量；未与其他新兴检测方法如环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）直接比较。尽管如此，该检测的分析性能和单管形式支持进一步评价其在现场流行病学监测中的潜在用途。

研究结论翻译：总之，本研究应用并初步评价了一种用于检测犬粪中多房棘球绦虫虫卵的单管巢式双重MGB探针实时PCR方法。该检测在流行区犬粪监测中显示出潜力，但其在环境样本中的应用及诊断敏感性和特异性仍需进一步评价。