智利鲑鱼养殖中海虱（Caligus rogercresseyi）携带鱼源性病原菌Tenacibaculum属的首次双重证据：基于免疫组化与PCR的病原携带潜力研究**

《Parasitologia》：Detection of Tenacibaculum spp. in Caligus rogercresseyi: Evidence of Potential Pathogen Carriage in Salmon Aquaculture

摘要专业翻译 海虱（Caligus rogercresseyi）是智利鲑鱼养殖中的主要外寄生虫，造成经济损失并增加鱼类对继发感染的易感性。腱杆菌病（Tenacibaculosis）近年来已成为养殖鲑鱼死亡的第二大原因。因此，了解海虱是否可能携带或传播细菌性病原体具有高度相关性。研究人员在智利洛斯 Lagos 地区（Los Lagos Region）一处大西洋鲑（Salmo salar）养殖场开展了一项海虱调查。研究人员采用结合特异性抗体的免疫组化（immunohistochemistry, IHC）与带适当对照的常规聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）的综合方法，分析了20只成年寄生虫（10只卵雌虫和10只雄虫）。免疫组化结果显示，Tenacibaculum maritimum 在胃肠道和角质层中呈阳性信号，Tenacibaculum dicentrarchi 在 C. rogercresseyi 的角质层和卵囊中呈阳性信号。特异性PCR检测证实了两种病原体的存在，分别扩增出 T. maritimum 的1088 bp 和 T. dicentrarchi 的284 bp 扩增产物。本研究通过PCR和免疫组化提供了 C. rogercresseyi 中 Tenacibaculum 属物种存在的首次双重证据。这些发现表明，海虱可能在鲑鱼养殖中的病原体动态中发挥作用，凸显了进一步研究其对水产养殖系统内疾病传播贡献的必要性。

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一、研究背景与问题

在智利，由鱼类外寄生虫 Caligus rogercresseyi 引起的海虱病（Caligidosis）是鲑鱼养殖中造成重大经济和健康影响的主要病害之一，大西洋鲑（Salmo salar）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）是最易受感染的养殖品种。除防治成本带来的经济损失外，寄生虫感染对鱼类的伤害还表现为皮肤损伤、慢性应激以及可能增加的继发感染易感性。

腱杆菌病（Tenacibaculosis）目前被认为是全球范围内影响海水鱼类和鲑鱼养殖的最重要的新兴细菌性疾病之一。该病由多种 Tenacibaculum 属物种引起，以严重的溃疡性皮肤病变、渗透压调节受损、摄食减少和高死亡率为特征，尤其在幼鱼中表现突出。在智利，腱杆菌病已成为影响大西洋鲑生产的第二大细菌性疾病，相关死亡率从2018年的约1%上升至2025年的8.1%。自被动监测计划（PVP）实施以来，T. dicentrarchi 占确诊病例的70%以上，其次为 T. maritimum。由于目前智利尚无注册的商业疫苗用于该病防控，疾病治疗仍高度依赖抗菌药物。因此，阐明 Tenacibaculum 属的流行病学、传播途径和潜在生物储存库已成为改善疾病预防和减少抗生素使用的优先事项。

尽管 Tenacibaculum 属被公认为重要的鱼类病原体，其自然储存库和传播途径仍未完全明确。这些细菌已从海水、沉积物、鱼体黏液和感染组织中分离获得，提示存在多种环境和生物储存库。除水媒传播和鱼类间直接传播外，海洋外寄生虫已被提议作为 Tenacibaculum 属的潜在携带者。智利最近的流行病学证据显示，C. rogercresseyi 感染使腱杆菌病相关死亡风险增加三倍以上（OR = 3.23）。此前研究已在北半球的 L. salmonis 中鉴定出多种细菌病原体，包括 A. salmonicida、T. maritimum、Pseudomonas fluorescens 和 Vibrio 属等。对 C. rogercresseyi 的微生物组分析也显示，鱼类病原体 Tenacibaculum ovolyticum 是最具代表性的细菌基因组。然而，病原体检测本身并不一定证明传播能力，区分病原携带与真正的媒介能力至关重要。

基于上述背景，研究人员提出假设：C. rogercresseyi 可能在特定解剖结构中携带 Tenacibaculum 属物种，支持其作为鲑鱼养殖中细菌携带者的潜在角色。本研究旨在通过常规PCR和免疫组化（IHC）首次报道在智利洛斯 Lagos 地区鲑鱼养殖场采集的寄生虫中检测到鱼类病原体 T. maritimum 和 T. dicentrarchi。

二、研究设计与方法概述

本研究是一项初步观察性调查，旨在通过互补的分子和组化技术检测 C. rogercresseyi 中 Tenacibaculum 属的存在。2021年1月，研究人员从智利南部洛斯 Lagos 地区一处养殖场的五条大西洋鲑上随机采集了20只成年 C. rogercresseyi 标本（10只卵雌虫和10只雄虫）。采样时鱼类未呈现符合腱杆菌病的临床症状。每种性别的5只寄生虫用10%缓冲福尔马林固定用于组织学分析，其余标本单独保存在RNAlater?中用于分子分析。

研究采用了两个关键技术手段：一是免疫组化（IHC），使用针对 T. maritimum（分离株Tm-035，源自虹鳟）和 T. dicentrarchi（分离株Td-005，源自2018年疫情中患病大西洋鲑）的特异性抗体，以1:2000稀释度孵育，通过NovaRED试剂盒显色，在光学显微镜下观察阳性信号；二是物种特异性常规PCR，使用MAR1/MAR2引物对检测 T. maritimum（预期扩增产物1088 bp）和Tenadi Fw/Rv引物对检测 T. dicentrarchi（预期扩增产物284 bp），以 T. maritimum NCIMB 2154? 和 T. dicentrarchi NCIMB 15498? 标准菌株DNA作为阳性对照，以不含DNA模板的反应作为阴性对照，所有样品和对照均进行重复分析。

三、研究结果

3.1 免疫组化检测 C. rogercresseyi 中的 Tenacibaculum

免疫组化分析揭示了 T. maritimum 存在于海虱 C. rogercresseyi 的不同解剖结构中。在雄性和雌性寄生虫的角质层浅表区域观察到轻度至中度的阳性信号，表明该细菌能够黏附或定殖于寄生虫外部组织。在胃肠道区域也观察到一致的阳性反应，尤其在雌性寄生虫中，多个区域呈现阳性信号。

针对 T. dicentrarchi 的免疫组化检测中，阳性信号主要出现在外寄生虫的角质层以及卵囊的浅表区域，其中卵囊区域观察到一致的中度免疫反应性。这一发现提示 T. dicentrarchi 可能与生殖结构相关，可能参与水平传播乃至潜在的垂直传播途径。

3.2 基于特异性PCR的 C. rogercresseyi 中 Tenacibaculum 属检测

对10份寄生虫样本（5只雄虫和5只卵雌虫）分别进行常规PCR检测。10份样本中有5份（5/10）检测出 T. maritimum 阳性，扩增出1088 bp的特异性片段。在 T. dicentrarchi 的检测中，10份样本中有7份（7/10）检测出阳性，扩增出284 bp的特异性片段。阳性对照与本研究使用的参考菌株产生的扩增片段大小一致，阴性对照无扩增产物，验证了检测体系的可靠性。

四、讨论与结论

讨论部分总结

外寄生虫日益被认为是水产养殖中传染病传播的重要驱动因素。大西洋鲑的皮肤微生物群在塑造与 C. rogercresseyi 相关的细菌群落中发挥核心作用。当寄生虫以宿主黏液和表皮组织为食时，不仅获取细胞碎片，还会获得皮肤表面栖息的细菌。此前研究中 Tenacibaculum 被鉴定为优势属，但受限于高通量测序技术通常仅能将细菌鉴定到属水平，无法实现种级分辨率。相比之下，本研究通过物种特异性PCR和免疫组化提供了 T. maritimum 和 T. dicentrarchi 在 C. rogercresseyi 中存在的直接证据。

组织学分析进一步证明了两者在寄生虫内的组织特异性定位。T. maritimum 在浅表角质层和胃肠道多个区域呈阳性，T. dicentrarchi 在角质层和卵囊浅表区域被检测到。这些定位模式表明病原体不仅限于外部污染，还可能持续存在于寄生虫内部。对于 T. maritimum，其表面相关的生活方式（形成生物膜的能力）为在寄生虫角质层和其他界面上的持久性提供了合理解释。

类似情况已在其他宿主-寄生虫系统中得到记录。例如，水螅水母 Phialella quadrata 被报道可作为 T. maritimum 的储存库和传播媒介，在苏格兰引起大西洋鲑鳃病。北半球的 L. salmonis 已与多种细菌和病毒病原体相关联。实验研究也证明 L. salmonis 可充当IHNV的机械性（而非生物性）传播媒介。

然而，在寄生虫内检测到微生物并不必然证明媒介能力，成功的病原体传播需要获得、持久存在和向易感宿主转移的实验证据。此前关于 L. salmonis 和 C. rogercresseyi 的研究强调了区分病原携带与真正媒介能力的重要性。

结论部分翻译

本研究首次通过免疫组化和PCR的联合使用，报道了 Caligus rogercresseyi 中 Tenacibaculum 属物种的存在。虽然PCR确认了 T. maritimum 和 T. dicentrarchi 的存在，免疫组化则提供了它们在寄生虫内解剖学定位的证据。结果表明，C. rogercresseyi 能够携带这两种病原体，支持了 C. rogercresseyi 在鲑鱼养殖中作为 Tenacibaculum 属携带者的潜在角色。这些发现拓展了当前关于养殖系统中潜在病原体储存库的知识；然而，这些结果应被解读为病原携带的证据而非传播的证据，因为本研究未产生媒介能力或病原体传播的证据。需要开展实验研究以确定 C. rogercresseyi 是否可作为 Tenacibaculum 属的机械性或生物性传播媒介。