琥珀酸驱动的甲基噻唑四氮唑（MTT）还原与线粒体电子传递链（ETC）活性的偶联：来自美洲大蠊（Nauphoeta cinerea）和斑马鱼（Danio rerio）亚细胞组分分离的比较证据

《Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology》：Succinate-driven methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) reduction is coupled to mitochondrial electron transport chain (ETC) activity: comparative evidence from subcellular fractionation in the lobster cockroach ( Nauphoeta cinerea) and zebrafish ( Danio rerio)

　　

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  MTT还原与线粒体电子传递链活性紧密耦合。
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  琥珀酸引导电子通过线粒体呼吸进行流动。
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  线粒体富集增加MTT还原能力。
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  ETC抑制剂揭示复合物II-IV参与MTT还原。

引言

基于甲硫四氮唑（MTT）盐的比色法被广泛用于评估细胞还原能力，自Mosmann于1983年将其引入以来，已成为评估细胞活力、增殖和代谢活性的标准工具（Mosmann, 1983; Stepanenko和Dmitrenko, 2015; Buranaamnuay, 2021; Ghasemi等, 2021）。该比色法基于黄色四氮唑染料MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四氮唑溴化物）被还原为不溶性的甲氧基偶氮产物，该产物可通过分光光度法进行定量，通常被解释为细胞代谢活性的代理指标（Berridge和Tan, 1993; Stockert等, 2018; Ghasemi等, 2021; Xu等, 2023）。由于其简便性和敏感性，MTT比色法已广泛应用于毒理学、药理学和线粒体研究（Mosmann, 1983; Berridge和Tan, 1993; Surin等, 2017; Rai等, 2018; Stockert等, 2018）。

尽管MTT比色法被广泛使用，但负责MTT还原的酶系统和亚细胞位点仍未完全阐明。早期研究强调了局部线粒体来源，确立了在底物支持条件下，四氮唑还原由呼吸链活性和线粒体内膜脱氢酶强烈驱动这一结论（Slater等, 1963; Berridge和Tan, 1993; Liu等, 1997）。然而，随后的生化表征揭示了包括细胞质、内质网和质膜在内的线粒体外隔室中存在大量非线粒体还原能力，由多种微粒体氧化还原酶、DT-二硫醇酶和跨质膜电子转运系统介导（Bernas和Dobrucki, 2000; Diaz等, 2007; Stockert等, 2012）。这种隔室化和酶学异质性引发了关于MTT还原主要反映线粒体功能还是更广泛分布的细胞氧化还原活性的持续争论（Patel等, 2013; Riss等, 2016a; Surin等, 2017; Rai等, 2018）。

影响MTT测量解释变异性的一个关键因素是所使用的代谢底物（Stepanenko和Dmitrenko, 2015; Ghasemi等, 2021）。琥珀酸在这方面特别具有参考价值，因为它被位于线粒体内膜的琥珀酸脱氢酶（SDH）氧化，电子随后被转运至线粒体泛醌（CoQ）池，并进一步通过呼吸链传递（Murphy和Chouchani, 2022; Goetzman等, 2023）。因此，与那些需要上游代谢加工才能产生还原当量的底物不同，琥珀酸提供了一种相对直接的手段，将电子供应至线粒体电子传递链（ETC）的复合物II（Berridge和Tan, 1993; Liu等, 1997; Bennett等, 2022; Esteban-Amo等, 2024; Bao等, 2025）。先前的研究表明，琥珀酸支持分离线粒体的MTT还原，且该活性对靶向线粒体电子转运组分的抑制剂敏感，提供了琥珀酸支持的MTT还原与线粒体ETC活性之间存在关联的证据（Berridge和Tan, 1993; Liu等, 1997）。然而，在不同动物模型中，琥珀酸驱动的MTT还原是否优先与线粒体组分相关联，在可比实验条件下尚未进行系统性考察。

为解决这一问题，我们选择美洲大蠊（Nauphoeta cinerea）和斑马鱼（Danio rerio）作为互补的无脊椎动物和脊椎动物模型。两者都拥有保守的线粒体生物能量学途径组分，同时代表不同的进化和生物学背景。斑马鱼（D. rerio）是线粒体生物学、毒理学和生物能量学研究中的成熟脊椎动物模型，因其保守的线粒体生理学特性、遗传可操作性以及适用于线粒体疾病和生化毒理学研究的便利性（Pinho等, 2013; Fichi等, 2019; do-Amaral等, 2021）。相反，美洲大蠊（N. cinerea）提供了一个实验可及的昆虫模型，越来越多地被用于神经毒理学、氧化应激和线粒体研究（Obafemi等, 2023; Adedara等, 2025; Nwawuba等, 2025）。因此，比较这些模型提供了确定琥珀酸驱动的MTT还原与线粒体ETC活性之间的关联是否在生物学上不同的动物系统中均可检测的机会。

动物组织的使用与MTT在培养细胞系中的常规应用存在根本差异（Berridge和Tan, 1993; Stockert等, 2018）。虽然完整细胞培养中的MTT还原反映总细胞活力、内体转运和跨质膜电子转运（Bernas和Dobrucki, 2000; Riss等, 2016b），但离体组织分级允许评估底物特异性呼吸链活性和局灶性线粒体电子转运（Berridge和Tan, 1993; Fedotcheva等, 2017）。本研究未将MTT还原作为细胞活力、增殖或整体细胞代谢活性的代理指标，而是在分离的亚细胞分级中考察MTT还原，以探究其生物化学和隔室化基础。该方法允许分别考察线粒体和非线粒体分级，从而解决仅从完整细胞获得的整合MTT信号无法解决的问题。此外，使用无脊椎动物和非哺乳脊椎动物还能为高等哺乳动物模型提供实验上可操作的替代方案，符合3Rs框架中更广泛的减少和替代原则（Obafemi等, 2023; Adedara等, 2025; Nwawuba等, 2025）。

已明确建立，MTT比色法有时可能产生不一致的结果，这一效应已归因于几个实验变量，包括MTT和底物浓度、样本蛋白浓度、样本类型，以及特别是在细胞研究中，细胞培养基成分和细胞接种密度（Stepanenko和Dmitrenko, 2015; Rai等, 2018; Carre?o等, 2021; Ghasemi等, 2021）。当比较不同生物系统中的MTT还原时，这些变量尤其相关，因为组织成分、线粒体丰度、底物利用和亚细胞酶分布的差异可能影响测量的甲氧基偶氮信号（Stepanenko和Dmitrenko, 2015; Ghasemi等, 2021）。因此，仔细优化MTT比色法，在每种实验模型中考虑这些变量，对于最小化MTT基于测量的解释歧义至关重要。

因此，本研究在受控实验条件下，系统考察了美洲大蠊（N. cinerea）和斑马鱼（D. rerio）亚细胞分级中琥珀酸驱动的MTT还原。通过将亚细胞分级与线粒体ETC抑制剂分析相结合，我们评估了MTT还原活性在细胞分级中的分布，并确定了琥珀酸支持的MTT还原与线粒体电子转运活性相关联的程度。这种比较方法提供了实验证据，以阐明线粒体对琥珀酸驱动的MTT还原的贡献及其在两种不同动物模型中的解释。

章节摘要

化学品

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、乙二醇双(β-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸（EGTA）、氯化钾（KCl）、氯化镁（MgCl₂）、二甲基亚砜（DMSO）、2,4-二硝基苯酚（DNP）、甘露醇、蔗糖、乳清酸、牛磺酸、琥珀酸、丙二酸、谷氨酸、丙酮酸、苹果酸、鱼藤酮、叠氮化钠和安替霉素均购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市）。

美洲大蠊和斑马鱼的饲养与维护

结果

数值以均值 ± 标准差表示（n = 3个生物学重复，每个重复测量两次）。琥珀酸特异性活性表示在每个细胞分级中使用琥珀酸作为底物测量的MTT还原速率（ΔA???/mg蛋白/h）。S1、S2和S3代表连续的上清分级，而P2和P3分别代表线粒体富集分级。总活性百分比表示每个分级对总琥珀酸驱动MTT还原的贡献。

讨论

本研究证明，在琥珀酸驱动条件下，MTT还原活性在美洲大蠊（N. cinerea）和斑马鱼（D. rerio）中主要定位于线粒体分级，非线粒体隔室的贡献有限。通过整合亚细胞分级、底物特异性分析、蛋白依赖性分析和靶向抑制，这些发现建立了当[底物为琥珀酸时]MTT还原与线粒体电子转运之间的直接功能联系。

结论

本研究证明，MTT还原的解释强烈依赖于底物选择和实验条件。通过在美洲大蠊（Nauphoeta cinerea）和斑马鱼（Danio rerio）中整合分级分离、底物分析和抑制剂分析，我们表明，在琥珀酸驱动条件下，MTT还原活性主要定位于线粒体分级，并与电子传递链功能紧密耦合。相比之下，非线粒体贡献变得[减少]。

CRediT作者贡献声明

Stanley U. Nwawuba：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿撰写，软件，方法学，调查研究，数据管理，概念化。Sabrina A. Ferreira：写作 – 审阅与编辑，方法学，调查研究，形式分析。Nilda V. Barbosa：写作 – 审阅与编辑，验证，监督，方法学。Isaac A. Adedara：写作 – 审阅与编辑，监督，方法学，形式分析。Michael Aschner：写作 – 审阅与编辑，验证，监督。Joao B.T. Rocha：

动物对象

本研究按照ARRIVE（动物研究：活体实验报告）指南进行。本研究获得了圣玛丽亚联邦大学动物伦理委员会的批准（批准号：方案号8468271022）。

利益冲突声明

作者没有需要声明的利益冲突。

致谢

Stanley Udogadi Nwawuba是CAPES-PROEX博士奖学金获得者，谨此感谢巴西高级专业人员进修协调委员会（CAPES）通过学术卓越计划（PROEX）（项目号：88887.978157/2024-00，财务代码001）提供的财政支持。本工作还得到了南大河州研究资助基金会（FAPERGS）和国家科学与技术发展委员会

Stanley U. Nwawuba|Sabrina A. Ferreira|Nilda V. Barbosa|Isaac A. Adedara|Michael Aschner|Joao B.T. Rocha