太平洋盲鳗（Eptatretus stoutii）肝脏、肌肉和心脏组织特异性代谢物对长期缺氧暴露的响应

《Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology》：Tissue specific metabolite responses of the liver, muscle and heart of the Pacific hagfish, ( Eptatretus stoutii) to prolonged anoxia exposure

　　

太平洋盲鳗（Eptatretus stoutii）是一种无颌类鱼，能在实验室条件下于10?℃存活36小时的完全缺氧环境。本研究利用核磁共振（NMR）波谱技术，检测了该物种在6小时和24小时缺氧暴露后，其体心、白色肌肉和肝脏中的极性代谢物变化。结果显示，6小时缺氧对各组织代谢物水平影响甚微。而24小时缺氧后，体心中乳酸（lactate）含量显著升高3533.61%，琥珀酸（succinate）升高798.44%；白色肌肉中乳酸升高101.66%，琥珀酸升高254.32%；肝脏中乳酸升高1609.12%，但琥珀酸无显著变化。此外，还检测到N-甲基牛磺酸（N-methyl taurine）、葫芦巴碱（homarine）和海葵素（zooanemonin）等非典型代谢物。研究表明，太平洋盲鳗的缺氧代谢反应与红耳龟（Trachemys scripta）相似，表现为高乳酸积累和低琥珀酸积累，而与鲫鱼（Carassius carassius）的低乳酸高琥珀酸模式不同。这种代谢策略可能有助于减少复氧时的线粒体损伤。

研究背景与科学问题

缺氧（anoxia）是指环境中完全缺乏氧气，对大多数脊椎动物而言是致命的胁迫。然而，少数物种演化出了非凡的耐缺氧能力。太平洋盲鳗（Eptatretus stoutii）作为一种深海 scavenger，能够在10?℃下耐受长达36小时的完全缺氧环境。此前研究已揭示其具备极低的静息代谢率、缺氧期间进一步抑制代谢的能力以及高度依赖糖酵解（glycolysis）供能的生理特征。然而，与其他著名的耐缺氧物种如红耳龟（Trachemys scripta）和鲫鱼（Carassius carassius）相比，盲鳗缺乏矿化骨骼用于缓冲酸中毒，也不具备将乳酸发酵为乙醇的独特通路。因此，研究人员提出疑问：太平洋盲鳗如何在相对有限的生理工具集下应对缺氧？本研究旨在通过代谢组学（metabolomics）手段，系统分析盲鳗在缺氧暴露下肝脏、肌肉和心脏的组织特异性代谢物变化，重点关注乳酸（lactate）和琥珀酸（succinate）这两种关键代谢物的积累模式，从而揭示其耐缺氧机制及其与已知耐缺氧物种的异同。

研究方法与技术路线

研究人员从加拿大不列颠哥伦比亚省巴克利湾采集太平洋盲鳗，运输至圭尔夫大学后，在10?℃、32?ppt盐度的人工海水中驯养。实验采用3?L呼吸计量室进行缺氧暴露，通过氮气鼓泡产生缺氧水（0%空气饱和度），分别设置6小时和24小时两个缺氧时间点，每个处理组均设相同时长的常氧对照组，每组6个生物学重复。缺氧结束后迅速处死动物，取体心、白色肌肉和肝脏组织，用干冰预冷的铝钳夹紧冷冻，保存于?80?℃。代谢物提取采用甲醇-氯仿-水法，仅取极性层用于后续分析。样品经冻干后重溶于含内标TMSP的磷酸钠缓冲液，使用600?MHz Bruker Avance III NMR波谱仪采集数据，采用noesypr1d脉冲序列。谱图通过Chenomx v10.0软件进行代谢物鉴定与定量，对于数据库中未收录的代谢物（如homarine、zooanemonin、N-methyl taurine），结合¹³C-HSQC、¹³C-HMBC和¹⁵N-HMBC二维谱及文献化学位移值进行确认。统计采用双尾t-检验（α?<?0.05），数据满足正态分布和方差齐性，异常值通过Grubb检验剔除。

研究结果

3.1 体心

6小时缺氧后，体心中24种可定量代谢物中有4种发生显著变化：2-羟基戊二酸（2-hydroxyglutarate）升高74.94%，天冬酰胺（asparagine）由低于检测限变为可检出，延胡索酸（fumarate）降低59.23%，异亮氨酸（isoleucine）由低于检测限变为可检出。24小时缺氧后，乳酸浓度从0.68?nmol/mg飙升至24.56?nmol/mg（升高3533.61%），琥珀酸从0.04?nmol/mg升至0.34?nmol/mg（升高798.44%）。此外，丙氨酸（alanine）升高279.24%，谷氨酸（glutamate）降低76.89%，谷氨酰胺（glutamine）降低63.27%，甘油（glycerol）升高163.37%，甘氨酸（glycine）升高115.16%，肌苷（inosine）升高353.92%，苏氨酸（threonine）升高115.38%。

3.2 白色肌肉

6小时缺氧后，白色肌肉中20种代谢物均无显著变化。24小时缺氧后，乳酸升高101.66%，琥珀酸升高254.32%。同时，天冬酰胺降低86.85%，磷酸肌酸（creatine phosphate）降低91.55%。

3.3 肝脏

6小时缺氧后，22种代谢物中仅苯丙氨酸（phenylalanine）降低47.11%。24小时缺氧后，乳酸升高1609.12%，丙氨酸升高123.97%，谷氨酸降至检测限以下，谷氨酰胺降低77.91%。值得注意的是，肝脏中琥珀酸浓度在缺氧前后无显著差异。

3.4 非常见代谢物

在所有组织中，甜菜碱（betaine）是含量最丰富的代谢物，占总代谢物量的50%以上，且不受缺氧影响。此外，研究人员首次在脊椎动物中鉴定出三种非常见代谢物：N-甲基牛磺酸（N-methyl taurine）、葫芦巴碱（homarine）和海葵素（zooanemonin），这些化合物通常见于无脊椎动物，可能发挥渗透调节或抗菌功能。

讨论与结论

本研究表明，太平洋盲鳗在缺氧暴露下表现出强烈的组织特异性代谢响应。6小时缺氧对各组织代谢物影响有限，提示此时间窗口尚不足以触发显著的代谢重编程。24小时缺氧则引发剧烈变化，其中体心乳酸升高36倍，肝脏升高17倍，肌肉升高约2倍。这种高乳酸积累模式与红耳龟相似，而与鲫鱼不同——后者通过乙醇发酵避免了乳酸堆积。盲鳗心脏的持续工作需求解释了其最高的乳酸积累率，而肝脏可能作为循环乳酸的储存库或复氧后糖异生的底物来源。琥珀酸方面，心脏和肌肉中分别升高9倍和3.5倍，肝脏无变化，这与红耳龟的低琥珀酸模式一致，而不同于鲫鱼的高琥珀酸积累。低琥珀酸积累可能有利于减少复氧时活性氧（ROS）的产生，减轻线粒体损伤。氨基酸代谢的变化（如丙氨酸升高、谷氨酸/谷氨酰胺降低）提示三羧酸循环（TCA cycle）中间体的补充和NADH平衡的维持。甘油和肌苷的升高反映了能量储备的动员和AMP降解，磷酸肌酸的耗尽则指示肌肉能量受限。2-羟基戊二酸的升高可能参与缺氧诱导因子（HIF）信号通路的调控。

结论：太平洋盲鳗在缺氧暴露下的代谢响应更接近红耳龟的高乳酸-低琥珀酸模式，而非鲫鱼的低乳酸-高琥珀酸模式。这种策略使其能够在不具备特殊乳酸处理机制的情况下耐受数小时的缺氧环境，为其在深海食物残骸内部摄食提供了竞争优势。研究结果强调了组织特异性代谢在耐缺氧适应中的重要性，并为理解脊椎动物耐缺氧机制的进化多样性提供了新视角。