《Environmental Technology & Innovation》：Electrochemical aptasensor for carbendazim based on a rationally designed truncated aptamer and ratio-engineered urea-derived Co–Ni microflowers/rGO interface
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Carbendazim（CBZ）是一种广泛使用的苯并咪唑类杀菌剂，但其残留物对生态系统和公众健康构成严重威胁。在此，研究人员报道了一种基于协同工程策略的电化学适配体传感器，用于CBZ检测，该策略将CBZ适配体的理性截短与电化学筛选相结合，并采用系统优化的尿素衍
Carbendazim（CBZ）是一种广泛使用的苯并咪唑类杀菌剂，但其残留物对生态系统和公众健康构成严重威胁。在此，研究人员报道了一种基于协同工程策略的电化学适配体传感器，用于CBZ检测，该策略将CBZ适配体的理性截短与电化学筛选相结合，并采用系统优化的尿素衍生Co–Ni微花/还原氧化石墨烯（rGO）传感界面。通过Mfold预测的二级结构，设计了三种截短变体（T1、T2和T3），并基于CBZ诱导的电化学响应进行了比较评估。同时，合成了具有不同Co:Ni摩尔比（1:2、1:1和2:1）的尿素衍生Co–Ni微花，以优化双金属组成，其中Co:Ni 1:2组成在与rGO集成时表现出最高的电化学响应。将优化后的T1适配体通过1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯（PBASE）连接剂固定在rGO/Co–Ni（1:2）界面上，构建了完整的传感平台。所制备的适配体传感器在1 pg/mL至100 ng/mL的宽线性范围内实现了CBZ的灵敏检测，检测限（LOD）为0.8 pg/mL，并对其他农药（如carbaryl和diazinon）表现出优异的选择性。在实际样品评估中，该传感器在自来水、番茄、草莓和脱脂牛奶中实现了90.5%–125%的加标回收率，相对标准偏差（RSD）低于10%。这种对识别元件和传感界面的双重工程策略为开发用于食品和环境中小分子污染物监测的高性能电化学适配体传感器提供了一个通用框架。
论文解读
一、研究背景与意义
Carbendazim（CBZ，苯并咪唑类杀菌剂）是一种系统性的苯并咪唑类杀菌剂，广泛用于保护水果、蔬菜、谷物和中药材免受真菌感染。其杀菌机制在于与β-微管蛋白结合，从而破坏微管组装并阻断有丝分裂。然而，CBZ化学性质稳定、难以降解，导致其在土壤、水体、农作物及中药材中持续残留，造成环境累积和膳食暴露风险。毒理学研究表明，CBZ对人类健康和生态系统构成显著威胁，包括细胞毒性、胚胎毒性、肝毒性和生殖毒性，以及内分泌干扰、生殖细胞凋亡和致畸效应。美国环境保护署（US EPA）已将CBZ列为可能的人类致癌物（C类）。各国对CBZ的最大残留限量（MRL）标准差异显著，例如苹果中中国的MRL为5 mg/kg，日本为3 mg/kg，英国仅为0.2 mg/kg，而澳大利亚已完全禁用CBZ。这些严格的限量标准凸显了对水、土壤、中药材和食品中CBZ进行灵敏可靠监测的迫切需求。
传统的分析技术如液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）和气相色谱（GC）虽能提供高精度的CBZ定量检测，但受限于成本高昂、样品前处理繁琐以及需要精密仪器和专业操作人员，难以满足大规模和实时监测的需求。电化学适配体传感器因其抗体般的特异性、化学稳定性、易于固定化和低成本规模化制造等优势，成为极具吸引力的替代方案。
然而，已有CBZ电化学适配体传感器的研究主要聚焦于传感纳米材料的工程化，而识别元件（适配体）基本保持不变。通过SELEX筛选获得的全长适配体常含有对靶标识别贡献甚微的非必需核苷酸，这些多余序列可能形成不必要的二级结构、产生空间位阻或促进非特异性相互作用。此外，传感界面的理化性质和信号转导特性与分子识别的有效耦合同样关键。双金属Co–Ni材料因其组成可调、电活性位点丰富、比表面积大和协同物理化学性质而受到广泛关注，但尿素辅助合成Co–Ni材料的研究仍十分有限，且同时工程化识别元件与传感界面的协同策略在CBZ电化学传感领域尚属空白。
二、主要技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法开展研究：基于Mfold网络服务器预测全长CBZ适配体（59 nt）的二级结构，并据此理性设计三种截短变体（T1、T2、T3）；采用尿素辅助水热法合成不同Co:Ni摩尔比（1:2、1:1、2:1）的Co–Ni微花材料；通过滴涂法制备rGO/Co–Ni微花修饰的碳丝网印刷电极（SPE）；利用1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯（PBASE）作为双功能连接剂，通过π–π相互作用锚定于rGO表面，并通过NHS酯基与适配体末端氨基形成共价酰胺键；采用循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV）进行电化学表征；利用六氨合钌（RuHex）作为静电氧化还原探针评估适配体表面覆盖度；通过X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、扫描电子显微镜（SEM）、能量色散X射线光谱（EDX）和X射线光电子能谱（XPS）对材料进行理化性质表征。实际样品（草莓、番茄、脱脂牛奶和自来水）经提取处理后进行加标回收实验。
三、研究结果
3.1 理化与电化学表征
XRD分析显示合成的Co–Ni材料具有结晶性，其中Co:Ni 1:2样品衍射峰更尖锐，表明结晶度更高。FT-IR光谱证实了Co–O和Ni–O晶格振动以及尿素衍生物种的C=O和C–N振动。SEM图像显示形成了具有放射状纹理表面的微球（微花），其中1:2样品呈现更开放的针状形貌，平均尺寸为6.53 ± 2.08 μm，而1:1和2:1样品分别为3.13 ± 2.12 μm和2.93 ± 1.00 μm。EDX光谱验证了C、O、N、Co和Ni的存在，Co/Ni原子比分别为1.18、2.05和0.73，与设计组成趋势一致。电化学评估表明，所有rGO/微花电极均比单独rGO/SPE表现出增强的电流响应，其中Co:Ni 1:2组成的电极具有最高的电流响应和电化学活性表面积（ECSA为0.1684 cm2），因此被选用于后续适配体传感器构建。顺序滴涂rGO后再沉积Co–Ni微花的界面比物理混合共沉积方式提供了更优的电化学响应。
3.2 XPS分析
高分辨Co 2p光谱在约780.5和797.0 eV处显示Co 2p?/?和Co 2p?/?峰，伴随高结合能侧的震激卫星峰，特征性地表明Co2?物种存在于含氧/含氮化学环境中。Ni 2p光谱在约856.3和873.2 eV处显示Ni 2p?/?和Ni 2p?/?峰，确认Ni2?物种的存在。C 1s光谱分析显示，rGO修饰Co–Ni微花后杂原子键合碳（C–O/C–N）的相对强度增加，并出现归属于尿素衍生羰基物种的C=O特征峰。N 1s光谱在约398.5 eV处呈现主导峰，归属于尿素衍生Co–Ni微花相关的含氮物种。电极经PBASE和氨基修饰适配体功能化后，C–O/C–N贡献增加，N 1s光谱分解为约398.4 eV和400.5 eV两个组分，分别归属于胺基（–NH?）和酰胺基（–CO–NH–），证实适配体末端氨基与PBASE的NHS酯之间成功形成了共价偶联。
3.3 适配体传感器分步构建与电化学评估
DPV测量显示，在rGO/Co–Ni（1:2）电极上依次固定PBASE、适配体（Long、T1、T2或T3）和乙醇胺（EA）后，还原峰电流逐步降低，证实了分步表面功能化的成功和非特异性结合位点的有效封闭。CBZ孵育后，由于适配体–CBZ复合物的形成导致额外的空间位阻和界面电子转移阻力增加，DPV峰电流进一步显著抑制。在测试的序列中，T1功能化电极在CBZ添加后表现出最显著的电流变化。RuHex表面覆盖度分析显示，Long、T1、T2和T3的表观表面密度分别为2.05 × 1013、1.80 × 1013、3.70 × 1013和2.66 × 1013分子/cm2。值得注意的是，T1尽管表面覆盖度最低，却产生了最大的CBZ诱导电流变化，表明其优异响应并非源于更高的适配体表面密度，而应归因于理性截短设计——仅移除3′末端发夹结构，同时保留上部茎环、中央内部环和下部茎，这些保留的结构基序有利于维持CBZ识别的结构特征，同时减少不必要的结构柔性并改善靶标在电极表面的可及性。
优化后的rGO/Co–Ni（1:2）/PBASE/T1适配体传感器在1 pg/mL至100 ng/mL的宽浓度范围内表现出浓度依赖性的电流降低，对数尺度线性良好（R2 = 0.9853），线性方程为ΔI = 4.50 log[C] + 19.59。检测限（LOD）经空白测量（n = 3）计算为0.8 pg/mL，灵敏度优于大多数已报道的CBZ适配体传感器和分子印迹聚合物（MIP）传感器。选择性研究显示，仅CBZ产生显著信号变化，而carbaryl（CB）和diazinon（DIZ）即使在100 ng/mL浓度下响应可忽略，干扰物浓度增至1 μg/mL（CBZ的10倍）也未产生显著响应变化。短期储存稳定性评估显示，储存约一周的电极在不同分析物浓度下表现出可比较且一致的响应。传感器间重现性良好，三重复测量的RSD值低于10%。
3.4 实际样品应用
将优化后的适配体传感器用于加标自来水、草莓和番茄提取物以及脱脂牛奶中CBZ的测定。在1 ng/mL和100 ng/mL加标浓度下，回收率范围为90.5%–125%，RSD < 10%。水、草莓和牛奶的回收率为90.5%–111%，而番茄的回收率略高（123%–125%），表明存在适度的正基质效应，可能源于基质诱导的电化学响应增强。这一现象与复杂食品基质色谱农药分析中报道的基质诱导信号增强效应一致。
四、结论
本研究通过同时工程化分子识别元件和换能器界面，建立了CBZ电化学适配体传感平台。比较合成不同金属比例的Co–Ni微花表明，Co:Ni 1:2组成与rGO集成时提供了最优的整体电化学性能。同时，对亲本适配体的理性截短确定了T1序列为最优识别元件，提供了最高的CBZ诱导电化学响应和有利的信号转导。通过芘基连接剂将最优截短适配体整合到微花基界面上，实现了CBZ的高灵敏和高选择性检测，检测限达0.8 pg/mL，兼具宽线性范围、良好的抗干扰性能和短期储存稳定性。在番茄、草莓、水和牛奶基质中，适配体传感器实现了90.5%–125%的回收率。研究结果凸显了适配体截短与Co–Ni微花组成工程相结合作为提升电化学适配体传感器性能的通用策略的综合优势。该工作为食品安全和环境监测领域高性能电化学适配体传感器的开发提供了通用平台，为小分子污染物的实际现场分析奠定了有前景的基础。未来研究应涵盖长期稳定性评估、与结构相关干扰物的评价以及与HPLC或LC-MS/MS等成熟色谱方法的交叉验证。
