茭白（Zizania latifolia）发酵过程中动态风味形成与微生物演替：挥发组学（volatilomics）与宏基因组学（metagenomics）整合解析

《Food Chemistry: X》：Dynamic flavor formation and microbial succession during fermentation of water bamboo shoots: Insights from volatilomics and metagenomics

　　

茭白（water bamboo shoots，WBS）发酵过程中动态风味形成与微生物演替：来自挥发组学（volatilomics）和宏基因组学（metagenomics）的启示。共鉴定出14种气味活度值（OAV）>1且变量重要性投影（VIP）>1的关键挥发性有机化合物（VOCs）。系统表征了微生物群落演替。揭示了与关键风味化合物密切相关的核心微生物。重建了参与风味形成的潜在代谢途径。

研究背景：茭白（Zizania latifolia）在中国称“jiaobai”，为多年生水生草本，其食用膨大茎由Ustilago esculenta感染后形成，具有脆嫩质地和独特风味。茭白（water bamboo shoots，WBS）富含膳食纤维、蛋白质、维生素、矿物质及生物活性化合物，具抗氧化、抗炎、降血糖和降脂活性。浙江种植面积超过20,000 ha，年鲜产约500,000 tons。但鲜茭白采后易褐变、失水、木质化和质地软化，限制贮藏稳定性和商业流通。蔬菜发酵可延长货架期并改善感官与营养。发酵中微生物代谢将碳水化合物、蛋白质等内源底物转化为多种代谢物，塑造最终产品滋味和香气。有机酸（organic acids，OAs）主要贡献酸味和酸化，游离氨基酸（free amino acids，FAAs）参与滋味形成并作为香气前体。Zizania latifolia含16种FAAs，受品种和收获季节影响；OAs代谢与采后品质变化相关。研究人员此前用GC-IMS比较干燥方法，鉴定52种挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs），其中3-methyl-butanal和5-methyl-2-furfural为关键VOCs。但鲜茭白发酵（fermented water bamboo shoot，FWBS）中OAs、FAAs和VOCs动态演化尚缺乏系统表征，微生物演替与特定挥发物类形成机制及代谢途径作用理解不足。电子鼻（electronic nose，E-nose）和电子舌（electronic tongue，E-tongue）可用于多维风味表征；宏基因组测序比培养法和16S rRNA扩增有更高分类分辨率和功能基因/代谢通路表征能力。既有FWBS研究多关注工艺优化、盐浓度调节和乳酸菌筛选，未系统阐明微生物群落演替及其与风味形成互作。因此研究人员开展本研究。

研究人员系统检测FWBS发酵过程中OAs、FAAs和VOCs动态，用电子鼻和电子舌评价风味，用宏基因组测序表征微生物多样性和演替，多变量统计筛选关键特征VOCs，Spearman相关分析识别核心微生物。结果表明pH下降、滴定酸度升高，硬度和弹性下降；共检测到20种FAAs和10种OAs，γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）为主要FAA，乳酸为主要OA；E-tongue和E-nose将发酵区分为早期（第1–3天）、中期（第5天）和晚期（第7–9天）；顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC–MS）检测到76种VOCs，初期以酯类为主，后期酚类增加；14种关键差异VOCs被鉴定；微生物早期以Leuconostoc、Lactococcus和Weissella为主，中后期Lactiplantibacillus尤其Lactiplantibacillus plantarum更突出；京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能注释和Spearman相关分析显示碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、萜类生物合成和酯化途径与关键VOCs形成密切相关。该研究为阐明FWBS风味形成机制、筛选功能发酵剂和改进质量控制提供理论基础。

主要技术方法：样本为鲜茭白品种“Hangzhou”，来自上海青浦区商业农场（31°15′N，121°12′E；海拔3.0 m），收获后4 °C运至实验室，清洗切块，25 °C风干至水分70%，与6%（w/w）盐混合腌制，第1、3、5、7、9天取样。采用pH计和电位滴定测pH与滴定酸度，质构仪测硬度和弹性；UPLC-Q Exactive Orbitrap MS测FAAs和OAs；SA-402B电子舌和PEN3电子鼻评价滋味与气味；HS-SPME-GC–MS测VOCs并计算OAV；宏基因组Illumina PE150测序，MEGAHIT组装，DIAMOND比对NR数据库，KEGG注释，QIIME 2分析α/β多样性，线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）筛选差异菌，Spearman相关分析微生物与VOCs关系。

研究结果：3.1 理化分析：pH从第1天4.45降至第9天3.64，滴定酸度从0.28升至0.86 g/100 g；硬度和弹性持续下降，硬度从2850 g降至1760 g，弹性从0.92降至0.72。说明发酵酸化成熟，质地软化与植物组织破坏和细胞壁成分降解有关。3.2 FAAs分析：检测20种FAAs，按滋味分鲜、甜、苦、无味。总FAAs第5天最高499.23 μg/g，第9天降至374.96 μg/g；苦味氨基酸最多，甜味次之，鲜味。Asp和Glu第7天峰值，增强中后期鲜味；GABA为主要单体，第5天212.862 μg/g，可能与Glu经谷氨酸脱羧酶脱羧有关。3.3 OAs分析：检测10种OAs。初期草酸和苹果酸为主，草酸第1天5312.037 mg/kg后下降，苹果酸从3682.573降至25.597 mg/kg；柠檬酸、富马酸下降。乳酸快速增加，第5天最高13677.385 mg/kg，成为主要OA；琥珀酸第3天7638.416 mg/kg。丙酸、丁酸、异戊酸浓度较低，但可能增强发酵香气和风味复杂性。3.4 电子舌分析：酸、苦、涩、回味、鲜、丰富度、咸味均变化；第5天酸味响应最低，与乳酸积累一致。主成分分析（principal component analysis，PCA）PC1和PC2分别解释56.4%和21.5%，累计77.9%，样品无重叠，区分早期、中期和晚期；载荷图显示鲜、咸、涩、回味-A、丰富度在PC1正向，酸、苦、回味-B在负向。3.5 电子鼻分析：10个金属氧化物传感器中W1W、W1S、W2S、W2W、W5S响应强，提示醇、醛、酮、甲烷样化合物、硫化物、芳香化合物和氮氧化物参与香气演化；PC1解释94.98%，W1W、W2W、W2S、W1S、W3S、W5S正载荷。香气从原料向成熟发酵演变，但需GC–MS鉴定具体化合物。3.6 HS-SPME-GC–MS分析：检测76种VOCs，包括醇、醛、酯、酮、酸、酚、呋喃、烷烃、萜烯等；总浓度增加。第1天酯类占优，呈果甜清新；后期酚类增加并占优。热图显示hexyl acetate、ethyl acetate、2-methylbutyl 2-methylbutanoate、nonanal、3-methylbutanal第1天较高；phenol、4-vinylphenol、eugenol、2-methoxy-4-vinylphenol、acetic acid、hexanoic acid、octanoic acid后期增加。PCA和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）区分阶段，置换检验R²=0.571、Q²=?0.130；VIP>1的15种VOCs中，结合OAV>1，确定14种关键差异VOCs。香气由绿色新鲜转向酸性、果香和酯香。3.7 宏基因组分析：α多样性中Richness、Chao1、Shannon和Simpson第1至3天下降，第7天最高，第9天下降；Goods_coverage接近1.000。β多样性PCoA PCoA1和PCoA2分别解释66.5%和16.4%，第1天分离，第3、7、9天接近，聚类为三类。门水平Bacillota主导多数阶段，Pseudomonadota第7天增加。属水平早期Leuconostoc、Lactococcus、Weissella、Exiguobacterium；第3/5天Lactiplantibacillus增加；第7天Enterococcus、Pediococcus过渡；第9天Lactiplantibacillus、Leuconostoc、Weissella仍优势。种水平第1天Leuconostoc citreum、Leuconostoc mesenteroides、Weissella cibaria、Leuconostoc inhae为主，第3天Lactococcus chungangensis优势并持续至第9天；Venn显示共享2912个OTUs，第7天独特OTUs最多3962。3.7.1 微生物群落分类组成：LEfSe显示第1天富集p_Bacillota、c_Bacilli、o_Lactobacillales、g_Leuconostoc、g_Lactococcus、g_Weissella、s_Leuconostoc citreum、s_Weissella cibaria；第3天g_Lactiplantibacillus；第5天o_Alteromonadales、f_Shewanellaceae、g_Shewanella；第7天p_Pseudomonadota、c_Gammaproteobacteria、o_Moraxellales、f_Moraxellaceae、o_Pseudomonadales、g_Acinetobacter、g_Pseudomonas、g_Enterobacter；第9天f_Lactobacillaceae、s_Lactiplantibacillus plantarum。说明阶段依赖性演替，早期Leuconostoc/Weissella/Lactococcus，中后期Lactiplantibacillus突出。3.7.2 微生物功能注释：KEGG显示代谢最丰富，包括碳水化合物、氨基酸、能量、脂质、辅因子和维生素代谢。碳水化合物代谢全程高，利于乳酸、琥珀酸等OAs生成；氨基酸代谢参与FAAs释放转化；脂质和能量代谢与脂肪酸降解及醛、酮、酸、酯形成有关；辅因子和维生素代谢可能参与硫胺素、核黄素、烟酸、吡哆醇、叶酸、生物素、泛酸和辅酶A转化。膜转运和信号转导帮助摄取养分、输出OAs并适应酸胁迫；遗传信息处理功能丰富，表明微生物活跃生长和胁迫适应。3.8 微生物演替与风味形成整合关系：Spearman相关显示Exiguobacterium和Kolesnikvirus与2-nonanol、2-undecanone正相关；Lactiplantibacillus与pentanal、benzenepropanoic acid ethyl ester正相关；Weissella与4-ethylphenol、(?)-β-pinene、(?)-bornyl acetate负相关。相关网络显示Lactiplantibacillus、Lactococcus、Leuconostoc、Weissella、Acinetobacter、Pseudomonas和Shewanella与VOCs高连接；ethyl acetate、ethyl caprylate、ethyl palmitate、2-undecanone、pentanal、2-nonanol、α-pinene、β-pinene和4-ethylphenol为重要风味标记。KEGG重建表明碳水化合物代谢提供丙酮酸，转化为乙醇、乙酸、乙偶姻、双乙酰；脂肪酸降解和脂质氧化产pentanal、2-nonanol、2-undecanol、2-undecanone；氨基酸代谢尤其苯丙氨酸途径与4-ethylphenol和benzenepropanoic acid ethyl ester有关；萜类生物合成与α-pinene、β-pinene、borneol、(?)-bornyl acetate有关；酯化促进ethyl acetate、ethyl caprylate、ethyl palmitate生成。

讨论与结论：原文讨论认为微生物代谢活动在酸化、风味发展和品质形成中起关键作用，核心菌与关键VOCs相关性为风味质量控制和定向调控提供潜在靶点。结论翻译：本研究系统表征了FWBS发酵过程中风味化合物和微生物群落的动态变化。发酵中pH和滴定酸度分别下降和上升，硬度和弹性持续下降。共检测到20种FAAs和10种OAs，GABA为主要FAA，乳酸为主要OA。E-tongue和E-nose分析区分了FWBS发酵阶段，大致分为早期（第1–3天）、中期（第5天）和晚期（第7–9天）。HS-SPME-GC–MS检测到76种VOCs，初始阶段以酯类为主，后期酚类化合物日益丰富。基于VIP>1、OAV>1和P<0.05鉴定出14种关键差异VOCs。微生物群落演替显示，早期群落主要由Leuconostoc、Lactococcus和Weissella代表，而Lactiplantibacillus，尤其Lactiplantibacillus plantarum，在中后期更突出。KEGG功能注释和Spearman相关分析进一步表明，碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、萜类生物合成和酯化途径与14种关键VOCs形成密切相关。这些结果为阐明风味形成机制、筛选功能性发酵剂和改善FWBS产品质量控制提供了理论依据。