生物膜形成的支柱：宽场去卷积落射荧光显微镜揭示丝状真菌生物膜的新发育模型

《Food Research International》：The pillars of (biofilm) creation: widefield deconvolution epifluorescence microscopy reveals a novel developmental model for filamentous fungal biofilm

　　理解生物膜架构对于认识其生物学特性至关重要。• 荧光显微镜被用于研究生物膜的架构。• 描述了菌丝体和细胞外基质内的分化结构。• 首次描述了外多糖"烟囱"结构。• 这些外多糖"烟囱"可能参与了生物膜对抗微生物物质的抗性。**引言**Aspergillus flavus（黄曲霉）在全球范围内作为土壤腐生菌和机会性植物病原体存在，能在玉米、花生和棉籽等多种重要农作物上引发收获前和收获后的疾病（Amaike & Keller, 2011; Li et al., 2021; Tai et al., 2020）。该真菌是全世界污染食品和饲料的主要物种，能产生包括黄曲霉毒素在内的其他毒素，这些黄曲霉毒素是具有致癌性和致突变性的多酮类衍生次级代谢产物（Amaike & Keller, 2011; Tai et al., 2020）。该菌也是一种重要的机会性人类病原体，能在体外和体内以生物膜形式生长（Hernández-Benítez et al., 2025）。直到最近，丝状真菌的生物膜仍被描述为嵌入自产胶状细胞外基质（ECM）中的致密菌丝网络。这种较为简单的模型已被日益精密的显微学研究挑战，研究者们发现生物膜在结构上更为复杂、有序且具有动态性。例如，在Aspergillus fumigatus（烟曲霉）生物膜中，已观察到大量菌丝从基部菌丝体长出并主要垂直于底物生长，以及菌丝体架构对环境变化的响应变化（Kowalski et al., 2019；Kowalski, Morelli, Schultz, Nadell and Cramer, 2020）。在Aspergillus niger（黑曲霉）中也报告了垂直极化生长（Beauvais et al., 2007；Villena et al., 2010）。尽管生物膜在微生物学各领域的关注度日益提高，但对其形态、组织和发育的描述仍然稀少，且不足以全面理解其菌丝体和细胞外基质架构。光学显微技术对生物膜研究具有基础性意义，迄今为止，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）被认为是分析结构、功能和动态的最佳选择，因为它能够生成水化活体生物膜的实时三维（3D）信息（Franklin et al., 2015；Schlafer & Meyer, 2017；Smith & Franklin, 2023）。鉴于生物膜复杂的三维结构，CLSM 通过重建二维（2D）图像的垂直堆叠（称为Z轴堆叠）来实现结构成像。在CLSM中，激光激发生物膜内的荧光分子，发射光通过一个小孔进入探测器，从而消除所有非焦平面的光线。随后，通过分析Z轴堆叠序列，在计算机上获得生物膜的3D渲染图。尽管CLSM广泛用于生物膜研究，但其Z轴堆叠成像存在穿透深度浅（通常为50–150 μm）、因反复激光照射导致的显著光漂白，以及在活体样品中潜在的细胞毒性。此外，采集过程耗时且易受运动伪影影响，而轴向分辨率仍低于横向分辨率。此外，该方法的采集和维护成本较高。这些因素可能损害准确的3D重建，尤其是对成熟生物膜这类厚或致密的生物样品。此外，相对较慢的扫描速度使CLSM不适合筛选应用（Cleaver & Garnett, 2023；Smith & Franklin, 2023）。由于三维生物膜结构中焦外区域的背景信号较高，其他光学成像方法在生物膜研究中的应用有限。焦外光的背景信号会降低图像质量、对比度和信噪比。此外，背景信号会减少定量估计三维生物膜组分（如细胞数和基质材料体积）的能力。CLSM在生物膜成像方面的一种替代方案是宽场荧光显微镜（WEM）。然而，与CLSM相反，WEM固有的成像模糊，因为检测到了焦外光，从而产生雾状伪影，降低对比度并掩盖厚样品中的结构细节。为了克服这一局限，人们开发了反卷积方法，通过计算重新分配焦外光以提高图像清晰度和分辨率，由此产生了宽场反卷积荧光显微镜（WDEM）。最近，出现了一些更先进的技术，如计算清除，可实时消除背景雾化，增强三维图像对比度，超越了传统的反卷积（Schummacher & Bertrand, 2019）。反卷积的优点包括图像清晰度改善、信噪比提高、三维可视化更佳以及定量精度提升。在WDEM中，与使用激光激发荧光分子不同，使用发光二极管（LED）或卤素灯来激发荧光分子。与CLSM一样，WDEM通过一系列Z轴堆叠数据渲染3D图像。然而，WDEM不是使用小孔来过滤焦外光，而是采用计算反卷积清除方法来渲染3D图像并消除焦外雾化。反卷积程序现已集成到成像系统中，提供了即时查看对焦3D结构的能力（Smith & Franklin, 2023）。在大多数生物膜成像研究中，细胞使用荧光探针如卡绿素白（CFW）进行染色，这是一种非特异性荧光染料，通过结合β-1,3葡聚糖来染色真菌细胞壁（Beauvais et al., 2007；Gow, 2025；Rasconi et al., 2009）。通过特定荧光探针的使用，可以实现对细胞外基质中外多糖的成像，包括Con A-Alexa Fluor 488偶联物（Beauvais et al., 2007）。Con A（刀豆氨酸A）是一种凝集素，是一种选择性结合甘露糖、葡萄糖及其衍生物糖类的蛋白质，这些糖类是丝状真菌细胞外基质中外多糖的常见组分（Cavada et al., 2019）。使用固态核磁共振（NMR）波谱学检验细胞外基质组成，发现培养在RPMI培养基中的A. fumigatus生物膜细胞外基质主要由多糖（43%）和蛋白质（40%）组成，脂肪和芳香族化合物贡献剩余17%。本研究中样本的扫描电子显微镜（SEM）分析显示生物膜菌丝紧密堆积，并被紧密编织的细胞外基质网络包围，在某些情况下，基质将菌丝粘合成连续网络（Joubert et al., 2017；Reichhardt et al., 2015；Reichhardt, Joubert, Clemons, Stevens and Cegelski, 2019）。此前，反卷积也曾用于细菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜和细胞外基质的成像和3D渲染（Smith & Franklin, 2023）。然而，将该方法应用于丝状真菌生物膜和细胞外基质研究尚未有报道。本研究采用WDEM分析固着式浸没A. flavus生物膜中菌丝和多糖丰富的细胞外基质的结构演变。此外，我们提出了一种表征丝状真菌生物膜的方法，并获取高质量、清晰的图像。WDEM的使用使我们获得了迄今为止最具洞察力和视觉冲击力的真菌生物膜菌丝和多糖架构3D图像。**片段***菌株与培养条件*A. flavus LH0106是从土壤中分离的，来自圣保罗大学里贝朗普雷图哲学、科学与文学学校生物系真菌菌种保藏库。通过对保守区域（ITS1、5.8S 和 ITS2）和管家基因（微管蛋白和钙调蛋白）测序进行该菌株的分子鉴定。生产分生孢子的步骤：将真菌在5 mL马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（Acumedia, USA）中，于培养皿（60 × 15 mm）中培养。*宽场反卷积荧光显微镜揭示高度有序的菌丝发育和独特的多糖结构*使用Con A-Alexa Fluor 488偶联物染色突出了多糖积累区域，这些区域随着生物膜发育而增加。图像放大显示，早在16小时就出现各种双曲形体形"烟囱"结构——具有基底部和顶端扩展的空心管——由多糖组成（图1，图S1和S2——补充材料）。位于图像中心的烟囱表现为绿色圆形，因为垂直观察生物膜表面仅捕捉到...*讨论*在真菌生物膜中，特别是由Aspergillus属物种形成的生物膜中，结构异质性由菌丝体的组织驱动，促进形成大孔网络。采用先进成像方法（包括共聚焦荧光显微镜、3D重建和电子显微镜）的研究为这些系统中的通道样结构提供了直接证据（Cano-Pérez et al., 2026；Corrêa-Almeida et al., 2022；Morelli et al., 2021；Rodrigues & Romo, ...）*CRediT作者贡献声明*Camila Guedes Francisco：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、方法学、调查研究、形式化分析。Jo?o Paulo Rodrigues Marques：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、方法学、调查研究、形式化分析。Leonardo do Prado-Silva：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、方法学、调查研究、形式化分析。Guilherme Thomaz Pereira Brancini：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、方法学、调查研究。*未引用参考文献*Massey, Zarnowski and Andes, 2023*利益冲突声明*作者声明，他们不存在已知可能影响本论文报告工作的财务利益或个人关系。*致谢*作者衷心感谢圣保罗大学动物科学与食品工程学院分子形态生理学与发育实验室核心设施提供Leica DMi8和Mica宽焦深活细胞倒置显微镜的使用权限。我们感谢设施协调员Juliano Coelho da Silveira、Flávio V. Meirelles和Felipe Perecin提供的支持。本工作得到圣保罗州研究基金会（FAPESP）的支持。Camila Guedes Francisco | Jo?o Paulo Rodrigues Marques | Leonardo do Prado-Silva | Guilherme Thomaz Pereira Brancini | Helena Fabiana Reis de Almeida Saraiva | Luís Henrique Souza Guimar?es | Gilberto úbida Leite Braga