方法至关重要：非转移变量对核酸转移、持久性、流行性和恢复（TPPR）研究数据的影响

《Forensic Science International: Genetics》：Methods matter: On the impact of non-transferential variables on reported data of studies on nucleic acid transfer, prevalence, persistence and recovery (TPPR)

　　

“TransAct”是一个多实验室合作项目，旨在为法医核酸转移、持久性、流行性和恢复（transfer, persistence, prevalence and recovery, TPPR）研究的合理化奠定基础。由八个法医实验室组成的联盟系统调查了从标准化皮肤细胞、口腔细胞和游离DNA混合物（作为标准化模拟触摸DNA样本）中回收和定量DNA的实验室间和实验室内变异性，以提高对影响DNA-TPPR研究数据的因素的理解。在参与实验室中观察到绝对DNA产量的显著变异性（相同底物跨两个数量级，不同底物跨四个数量级），这主要归因于实验室间的方法学异质性。使用标准qPCR试剂盒进行的定量揭示，仅根据所应用的方法，测量到的DNA浓度就存在显著差异，进一步变异与采样技术和底物相关。通过Y染色体和常染色体qPCR靶标之比以及概率基因分型（EuroForMix）评估了降解的低模板两人混合模拟触摸DNA混合物（男性和女性贡献者）的混合物比例，揭示了两种方法和实验室之间的差异。这些发现强调，TPPR数据深受实验室特定方法学差异的影响，强调实验标准化和共享资源的迫切需要，以增强核酸TPPR研究的可靠性，从而改善法医遗传学中的活动水平评估。作为迈向数据收集协调的一步，这项工作提供了补充材料中详细文档的范例模板，涵盖实验室方法信息的收集和结果的标准化显示，以促进一致的数据报告和未来的数据汇总。

近年来，法医遗传学领域围绕DNA转移、持久性、流行性和恢复（DNA-TPPR）的研究日益增多，这些研究为活动水平评估（activity level evaluation, ALE）提供了核心数据支撑。然而，影响DNA-TPPR结果的因素不仅包括接触条件等转移变量（transferential variables），还包括实验室方法等非转移变量（non-transferential variables）。尽管转移变量已受到广泛关注，但非转移变量对研究报告数据的影响仍缺乏系统认识，尤其是回收方法、定量策略和解释模型的差异可能导致研究结果显著偏离真实情况，进而影响基于贝叶斯网络（Bayesian network, BN）的活动水平似然比计算。为了系统评估这种影响，研究人员发起了TransAct协作项目，制备了高度标准化的模拟触摸DNA样本，并组织八个法医实验室（包括五个学术性法医学研究所、一个德国州刑事警察局、德国联邦警察局以及一个私营商业实验室）按照各自常规案例流程开展比对研究，在DNA提取、定量、PCR扩增和数据分析各阶段进行系统比较。

在方法层面，研究人员通过混合手部擦拭物、提取DNA和口腔细胞构建了模拟触摸DNA细胞悬液，并将其分装至三种底物——塑料离心管、玻璃载玻片和织物上，同时制备了男女性贡献者比例为1:1和7:3的混合样本。各实验室对样本进行常规处理，协调实验室L01则对所有原始数据进行统一再定量和概率基因分型分析。主要技术手段包括定量PCR（quantitative PCR, qPCR）用于DNA定量，STR复合扩增和毛细管电泳进行分型，以及EuroForMix软件进行概率基因分型；混合比例通过Y染色体与常染色体qPCR靶标比值和基因分型结果两种方式独立估算。

研究结果主要包括四个方面。3.1 DNA产量和定量表现：L01初始测试显示不同底物样本的DNA产量介于11.97至24.35 ng之间；持久性实验表明，离心管样本在55天后回收量下降超过80%，而织物样本的回收量在55天时未见明显下降。各实验室的定量结果显示，织物样本的平均DNA回收量最高（11.31 ng），玻璃载玻片次之（6.90 ng），离心管最低（1.10 ng），且实验室间绝对DNA产量差异可达两个数量级，变异系数范围为5.68%至85.70%。将同一批提取物在L01进行再定量后发现，大多数实验室的初始定量值显著低于L01的再定量值，且该差异与所用定量试剂盒及测量时间无直接关联，提示可能存在批效应或标准品差异。3.2 DNA图谱解释：对于单源样本，除一个实验室外，所有实验室均报告单一贡献者图谱；统一分析显示未知组分比例仅为0.02–0.08。对于混合样本，Person A（女性主要贡献者）的log₁₀LR在几乎所有实验室中均大于4，而Person B（男性贡献者）的LR经常因等位基因丢失而低于阈值，这与实验室所用STR试剂盒和生物信息学软件的敏感性差异有关。3.3 使用概率基因分型的统一图谱解释：当采用统一的EuroForMix分析所有原始数据时，最佳拟合模型估算的贡献者数量（NoC）往往高于真实人数，但混合比例显示主要贡献者始终为Person A（Mx≥0.91），说明方法学差异会显著影响对混合物组成的判断。3.4 混合比例和解释一致性：通过qPCR计算得到的混合比例与概率基因分型结果存在系统偏差，尤其在降解严重的低模板混合物中，qPCR因靶标片段较短而能检测到男性DNA，而STR图谱可能因长片段等位基因丢失而无法检出该贡献者，导致DNA贡献量在不同方法间出现不一致分配。

讨论部分强调，本研究所观察到的实验室间差异与ReAct项目结果一致甚至更大，尽管本研究样本经过更严格的标准化，说明非转移变量本身即可引入显著变异。由于样本量和实验室数量有限，尚不能推导出可泛化的实验室间变异分布。研究人员建议在活动水平评估中审慎选择外部数据，并透明报告数据局限性。他们提供的标准化元数据收集模板和结果报告模板，以及开放数据共享的设想，是推动数据协调的重要步骤。同时，模拟触摸DNA制备中存在的DNA降解和口腔细胞比例过高问题提示，未来需进一步优化标准化样本体系。

结论：本研究明确证明，非转移变量广泛影响DNA回收、定量和谱图解释。研究人员展示了常规实验室方法的显著变异性，并确定qPCR检测、底物本身也导致实验室内部和实验室间差异。认识和考虑这些效应对于在活动水平评估中解释DNA-TPPR结果至关重要。提供的模板可帮助实验室收集必要信息，以应对TPPR实验和数据解释标准化的挑战。通过校准实验建立校正因子和通过贝叶斯网络纳入实验室变异性的方法可能均为可行的路径。研究人员提出了一种创建模拟触摸DNA的方案，但DNA完整性限制和口腔细胞的大量添加凸显了在评估非转移变量之前改进标准化样本制备的必要性。