CD73靶向联合治疗逆转CD73高表达PD-L1阴性非小细胞肺癌的PD-1抑制剂耐药：来自胸腔积液类器官模型的证据

《Global Medical Genetics》：CD73 Targeted Combination Therapy Reverses PD-1 Inhibitor Resistance in CD73-High PD-L1-Negative NSCLC: Evidence from Pleural Effusion Organoids

CD73靶向联合治疗逆转CD73高表达程序性死亡配体1（PD-L₁）阴性非小细胞肺癌（NSCLC）中程序性死亡受体1（PD-1）抑制剂耐药：来自胸腔积液类器官的证据

•患者来源的胸腔积液类器官-肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）模型重现了PD-L₁阴性NSCLC微环境。
•抗CD73联合抗PD-1在CD73高表达PD-L₁阴性NSCLC中产生协同抗肿瘤效应。
•CD73表达可作为难治性NSCLC联合免疫治疗的预测性生物标志物。

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占临床诊断的85%。程序性死亡受体1/程序性死亡配体1（PD-1/PD-L₁）免疫检查点抑制剂（ICIs）的出现革新了晚期NSCLC的治疗格局，为部分患者带来持久缓解和生存获益。然而，PD-1抑制剂单药治疗的临床疗效高度异质，约占晚期病例50%–60%的PD-L₁阴性NSCLC患者从抗PD-1单药治疗中获益甚微，且普遍存在固有性和获得性耐药。当前NSCLC免疫治疗的临床决策主要依赖PD-L₁表达作为唯一的预测性生物标志物，缺乏对PD-L₁阴性人群进一步亚型分层的有效标准，这一困境成为肺癌免疫治疗发展的主要瓶颈。CD73-腺苷信号通路已被证实是肿瘤微环境（TME）中的关键免疫抑制轴，与PD-1/PD-L₁通路共同介导肿瘤免疫逃逸。CD73由NT5E基因编码，是一种外核苷酸酶，可将一磷酸腺苷催化为腺苷，后者直接损害效应T细胞和自然杀伤细胞的功能，并促进肿瘤相关巨噬细胞向免疫抑制表型极化。临床前和早期临床证据表明，CD73抑制可有效逆转TME中腺苷介导的免疫抑制，且CD73抑制剂与PD-1抑制剂联合在多种实体瘤中显示出协同抗肿瘤效应。然而，现有研究多集中于未分层的NSCLC队列，针对CD73高表达PD-L₁阴性NSCLC亚群中PD-1抑制剂联合CD73抑制剂的治疗疗效仍缺乏研究，CD73表达作为该亚群分层预测标志物的潜力亦未得到验证。患者来源类器官（PDOs）是精准免疫治疗研究的强大临床前工具，胸腔积液来源类器官（PEOs）作为其亚型，可通过非侵入性取样从晚期NSCLC患者中分离，忠实保留原发肿瘤的组织学特征、遗传背景和标志物表达谱，并能与自体肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）共培养模拟体内肿瘤-免疫相互作用。基于此，研究人员利用PEO-TIL共培养系统，在驱动基因野生型PD-L₁阴性NSCLC中评估了抗PD-1、抗CD73及其联合方案的抗肿瘤疗效，并探究CD73作为预测性生物标志物的价值，以期为该难治亚群提供精准免疫治疗策略。

在研究方法上，研究人员从6例驱动基因野生型、PD-L₁阴性（肿瘤细胞比例评分TPS<1%）的肺腺癌患者胸腔积液中成功建立PEOs，通过苏木精-伊红（HE）和免疫组织化学（IHC）验证其与原发胸腔积液组织的标志物表达一致性，并根据CD73的IHC半定量评分（H-score=染色强度×阳性细胞比例，TS≥6定义为高表达）将模型分为CD73高表达（n=3）和CD73低表达（n=3）亚组。随后分离自体胸腔积液TILs，建立PEO-TIL共培养体系，设对照组（AMP）、抗PD-1单药组（特瑞普利单抗）、抗CD73单药组（Uliledlimab）及抗PD-1+抗CD73联合治疗组，共培养72小时。检测指标包括基于ATP法的肿瘤细胞活力（去除CD45⁺ TIL后）、ELISA检测细胞外腺苷浓度、流式细胞术分析CD4⁺/CD8⁺ T细胞亚群及CD25、CD137激活标志物，以及ELISPOT检测IFN-γ和TNF-α分泌水平。

**建立并验证PD-L₁阴性NSCLC PEO模型。** 通过HE和IHC检测，PEOs表达肺腺癌特异性标志物NapsinA、TTF-1（部分患者阳性）、局灶性p63，Ki-67证实增殖活性，PD-L₁表达均<1%，且各标志物表达模式与配对原发胸腔积液组织完全一致，确认了模型的高保真性。基于CD73表达评分，成功将6个模型分为高、低表达两组。

**CD73分层后不同治疗方案的抗肿瘤疗效。** 通过PEO-TIL共培养和ATP活力检测发现，抗PD-1单药在CD73高、低亚组中均未降低肿瘤细胞活力。CD73低亚组中，四种治疗方案均未显示明显肿瘤抑制作用，对照组细胞活力为62.72±31.50%，联合治疗组为61.47±31.73%。在CD73高亚组中，抗PD-1单药组活力为85.46±22.29%，抗CD73单药组为71.55±13.34%（未达统计学显著），而联合治疗组显著降低至59.70±8.94%（p=0.0032 vs. 对照）。联合治疗在CD73高亚组的肿瘤抑制率为25.30±2.24%，显著高于CD73低亚组的-0.27±8.56%（p<0.0001），且CD73表达水平与联合治疗肿瘤抑制率呈连续正相关。Bliss独立性模型显示，联合治疗的观察效应（25.30%）显著高于预期加和效应（5.14%），证实抗PD-1与抗CD73具有协同效应，且该协同效应仅存在于CD73高表达亚组。

**不同CD73表达亚组的细胞外腺苷水平。** ELISA检测显示，CD73低亚组各治疗组间腺苷浓度无显著差异；CD73高亚组中，对照组腺苷水平最高，抗PD-1单药未显著改变腺苷浓度，而抗CD73单药和联合治疗均显著降低细胞外腺苷，且幅度相当。这提示CD73表达水平决定细胞外腺苷积累，CD73阻断以CD73表达依赖方式减少腺苷产生。

**不同CD73表达亚组的T细胞亚群比例和激活状态。** 流式细胞术分析显示，CD4⁺和CD8⁺ T细胞比例在各处理组间无一致分布趋势，CD25⁺、CD137⁺及CD25⁺CD137⁺双阳性细胞频率在CD73高、低亚组间及不同治疗方案间均无统计学显著差异。

**不同CD73表达亚组的炎症细胞因子分泌谱。** ELISPOT检测结果显示，IFN-γ和TNF-α分泌细胞数在各处理组间、各CD73亚组内均无显著差异，与T细胞激活标志物检测结果高度一致。

在讨论部分，研究人员指出，PD-L₁阴性患者对PD-1单药反应差，CD73表达可有效分层这类异质性人群，CD73高表达是联合治疗获益的决定性因素。抗PD-1单药后肿瘤细胞活力的轻微升高可能反映了在深度耗竭的自体TIL背景下，单药无法恢复效应功能，而静息T细胞的弱背景炎症信号反而轻微促进肿瘤代谢活性。抗CD73单药虽降低腺苷，但PD-1/PD-L₁通路完整，故疗效有限；联合治疗同时阻断代谢轴和免疫检查点，产生强效协同作用。虽然T细胞经典激活标志物和细胞因子未显著变化，但腺苷降低与抗肿瘤效应不一致，提示机制可能涉及代谢重编程、其他免疫细胞群（如NK细胞、肿瘤相关巨噬细胞）或肿瘤细胞内在效应，具体机制需进一步研究。PEO模型高保真模拟原发肿瘤微环境，其与自体TIL共培养可部分重建肿瘤-免疫互作，但该模型存在样本量小、缺乏基质细胞和部分固有免疫成分、TIL体外扩增可能改变表型等局限。

研究结论总结如下：本研究解决了驱动基因野生型PD-L₁阴性NSCLC领域未满足的临床需求，利用高保真PEO模型证实CD73高表达是治疗获益的关键决定因素，抗PD-1联合抗CD73方案能有效逆转CD73高表达PD-L₁阴性NSCLC的PD-1抑制剂耐药，验证CD73作为分层该异质性人群的潜在预测性生物标志物。该研究为CD73高表达PD-L₁阴性NSCLC定义了靶向免疫治疗策略，推动多生物标志物分层向精准免疫治疗迈进，为后续临床试验和靶向联合药物开发奠定了关键的临床前基础。