基于环介导等温扩增联合侧流层析试纸条DNA生物传感器检测东南亚型α0-地中海贫血（--SEA缺失）的方法开发

《PLOS One》：Development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) combined with a lateral flow dipstick DNA biosensor for detection of α thalassemia 1 [Southeast Asia (SEA), --SEA deletion]

　　

本研究旨在开发一种一步式环介导等温扩增联合侧流层析试纸条（LAMP-LFD）DNA生物传感器，用于检测α0-地中海贫血（SEA缺失）。研究人员从48例α0-地中海贫血（SEA缺失）阳性和48例阴性（正常）泰国受试者中获取基因组DNA。使用针对α0-地中海贫血（SEA缺失）类型的特异性引物，在61℃条件下进行LAMP检测60分钟。扩增后，利用LFD在5-10分钟内对产物进行可视化检测。该一步式LAMP-LFD DNA生物传感器可检测低至200 pg的携带α0-地中海贫血（SEA缺失）类型的DNA，灵敏度和特异性均为100%。此外，未观察到与其他α0-地中海贫血缺失类型（THAI缺失）DNA的交叉反应。LAMP-LFD DNA生物传感器可用于鉴定α0-地中海贫血（SEA缺失）携带者（这是泰国及整个东南亚地区最常见的缺失类型）。这种新颖的一步式LAMP-LFD检测试剂盒将有益于医学实验室技术人员进行遗传携带者筛查测试，因其操作简便、所需设备少且耗时短。此外，该方法有助于临床医生提供遗传咨询，并对重型地中海贫血（泰国一项重大公共卫生问题）实施预防策略。

一、研究背景与目的

α-地中海贫血是一种常见的遗传性血液疾病，尤其在东南亚人群中高发。其中，东南亚（SEA）缺失型α⁰-地中海贫血是最常见的类型，其特征是一条染色体上的两个α-珠蛋白基因均发生缺失。若夫妻双方均为α⁰-地中海贫血（SEA缺失）携带者，其胎儿有罹患Hb Bart's水肿胎综合征的风险，这是一种致死性的重型地中海贫血，常导致胎儿或新生儿死亡。因此，对α⁰-地中海贫血进行准确的DNA分析，对于遗传咨询、高风险家庭的预防和控制至关重要。

目前，检测α⁰-地中海贫血的分子技术包括常规聚合酶链式反应（PCR）、多重PCR和实时荧光定量PCR等。然而，这些方法通常需要昂贵的仪器设备和较长的操作时间。近年来，基于环介导等温扩增（LAMP）的比色法被用于快速检测α⁰-地中海贫血，但传统LAMP产物的检测依赖琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，由于LAMP使用多对引物会产生复杂片段混合物，仅凭凝胶分析难以区分特异与非特异性扩增，存在假阳性风险。为解决这一问题，研究人员开发了一种结合LAMP与侧流层析试纸条（LFD）DNA生物传感器的一步式检测方法，旨在实现对α⁰-地中海贫血（SEA缺失）的快速、特异、灵敏且可视化的检测，无需复杂设备，适用于资源有限的医疗场所。

二、关键技术方法

研究人员首先设计了一组针对α⁰-地中海贫血（SEA缺失）断裂点区域的特异性LAMP引物，包括生物素标记的BIP引物和FITC标记的LB探针。随后，对LAMP反应条件（温度、MgSO₄浓度、dNTP浓度）进行了优化。LFD试纸条的制备采用了金纳米颗粒标记的抗FITC抗体，并在硝酸纤维素膜上固定了抗生物素抗体（测试线）和羊抗小鼠IgG（对照线）。检测流程为：在优化的条件下进行一步式LAMP扩增，然后将扩增产物与缓冲液混合，插入LFD试纸条，通过肉眼观察测试线和对照线的显色情况判断结果。临床验证使用了96份来自泰国宋卡王子大学医学院的DNA样本（48例阳性、48例阴性），所有样本先前均已通过常规PCR鉴定。

三、研究结果

LAMP反应条件的优化

研究人员分别在59℃、61℃、63℃和65℃下进行LAMP反应60分钟，发现61℃产生的条带最清晰、最强，因此选择61℃作为最佳反应温度。通过对MgSO₄浓度（2-12 mM）和dNTP浓度（0.4-1.6 mM）的优化，确定最佳MgSO₄浓度为4 mM，最佳dNTP浓度为1.2 mM。

最优FITC标记DNA探针浓度

研究人员评估了0.1 μM至0.4 μM的FITC标记探针浓度，发现0.2 μM浓度下测试线信号最强且无非特异性信号，因此选择0.2 μM作为最优浓度。

使用LFD DNA生物传感器检测一步式LAMP产物

研究人员成功利用LFD试纸条检测LAMP扩增子，无需凝胶电泳。阳性样本显示测试线和对照线两条可见条带，阴性对照仅显示对照线。LFD检测结果与琼脂糖凝胶电泳结果完全一致。

一步式LAMP-LFD DNA生物传感器的灵敏度

研究人员使用10倍系列稀释的α⁰-地中海贫血（SEA缺失）基因组DNA（20 ng至20 fg）评估分析灵敏度。结果表明，该检测方法的最低检出限为200 pg，在此浓度以下无信号。

一步式LAMP-LFD DNA生物传感器的特异性

研究人员分别使用α⁰-地中海贫血（SEA缺失）基因组DNA和其他α⁰-地中海贫血变异类型（包括THAI缺失）进行测试。结果显示，该检测方法与THAI缺失等非目标模板无交叉反应。

临床样本测试

研究人员对96份临床DNA样本进行一步式LAMP-LFD检测，并与常规PCR结果比较。结果显示，该检测方法的敏感性和特异性均为100%（95%置信区间：92.6%-100%），Cohen's kappa系数为1.0，表明与常规PCR完全一致，Fisher精确检验P值小于0.0001。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究所开发的一步式LAMP-LFD技术能够在1小时内完成检测（不含DNA制备时间），显著快于常规PCR（2-3小时）及LAMP联合凝胶电泳（2.5小时）。该方法操作简便、结果易读，无需特殊仪器，避免了溴化乙锭等致癌物的使用。相比酚红比色法等其他LAMP检测方式，LAMP-LFD通过特异性探针杂交提供明确的阴阳性判读，消除了颜色判读的主观性。尽管存在反应管开启可能带来气溶胶污染的风险，但可通过使用带滤芯吸头等措施加以防范。每份试纸条成本约9美元，与酚红法相当，但降低了因结果模棱两可而需复检的费用。研究局限性包括样本量相对较小（96例），且当前检测仅针对SEA缺失，未来可开发同时检测SEA和THAI缺失的多重LAMP-LFD平台，并评估干血斑或口腔拭子等样本类型的适用性。

研究结论：本研究开发了一步式LAMP-LFD方法用于鉴定α⁰-地中海贫血（SEA缺失）类型。该检测方法简便、快速，结果可用肉眼判读。作为一种经济有效的常规筛查工具，该方法在医院或医学实验室环境中显示出巨大潜力。在高流行国家，尤其是泰国及其他东南亚地区人群，这种新型一步式LAMP-LFD DNA生物传感器可作为排除α⁰-地中海贫血（特别是SEA缺失类型）的有力工具，有助于预防和控制重型地中海贫血。