整合基因组和功能分析鉴定出BCL10为子痫前期滋养细胞衰老的新型驱动因素

《Journal of Hypertension》：Integrative genomic and functional analysis identifies BCL10 as a novel driver of trophoblast senescence in preeclampsia

　　

**目标：** 鉴定与子痫前期（PE）存在因果关系的衰老驱动基因，并阐明其对胎盘功能障碍的影响。

**方法：** 对胎盘RNA测序数据集GSE234729进行分析，筛选差异表达基因。利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）提取子痫前期中与衰老相关的基因（ARGEs）。采用孟德尔随机化（MR）方法，结合GTEx中的表达数量性状位点（eQTLs）确定候选基因。体外验证实验采用H2O2（100 μM）处理HTR-8/SVneo细胞构建衰老模型，并通过BCL10过表达或沉默进行功能验证。衰老程度通过SA-β-gal染色和衰老相关蛋白检测定量，侵袭能力通过Transwell实验评估，迁移能力通过划痕实验检测。对BCL10沉默的细胞进行转录组分析。

**结果：** 整合GSE234729数据集后，我们鉴定出1488个差异表达基因和1649个WGCNA核心基因，最终获得39个衰老相关基因。孟德尔随机化分析将BCL10确定为子痫前期的风险因素。PE患者胎盘组织和H2O2处理的HTR-8/SVneo细胞均表现出显著的滋养细胞衰老特征。BCL10在PE中显著上调，伴随衰老标志物P62和MMP3的上调，且与分娩时体重指数（BMI）相关。功能实验显示，BCL10过表达可增加P53/P21/P16、减少Lamin B1、增强SA-β-gal活性并抑制侵袭；而siRNA介导的敲低则逆转了上述变化。HTR-8/SVneo细胞中BCL10沉默改变了722个基因的表达，这些基因富集于免疫炎症反应、凋亡及NF-κB和NOD样受体信号通路。

**结论：** BCL10是一种与子痫前期存在因果关系的促衰老因素，可损害滋养细胞功能。靶向BCL10可能为缓解子痫前期中的胎盘衰老相关并发症提供新策略。

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**引言**

子痫前期（PE）是一种妊娠特有疾病，其发病机制复杂，涉及滋养细胞侵袭受损、血管生成失衡、内皮细胞功能障碍、氧化应激和炎症反应等多种因素[1]。氧化应激、DNA损伤和炎症反应是诱导滋养细胞衰老的主要因素[2]。

细胞衰老的特征是不可逆的细胞周期停滞，通常由DNA损伤、端粒缩短或氧化应激引起[3]。衰老细胞体积增大，核膜皱缩，形态发生显著改变。衰老细胞分泌多种炎症因子（如白细胞介素IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α（TNF-α））和趋化因子，形成衰老相关分泌表型（SASP），这不仅促进局部炎症反应，还可能诱导周围细胞衰老[4]。因此，滋养细胞衰老导致胎盘血管网络形成缺陷，在PE的胎盘功能障碍中发挥重要作用[5]。

孟德尔随机化（MR）是一种以遗传变异作为工具变量来评估因果关系的研究方法[6]。近年来，MR方法已被用于探索遗传变异与PE风险之间的因果关系，为理解PE的遗传基础及识别潜在治疗靶点提供了重要线索[7]。

本研究整合胎盘RNA测序数据集GSE234729的转录组分析与加权基因共表达网络分析（WGCNA）和孟德尔随机化（MR），鉴定与PE相关的衰老相关基因（ARGEs）。结果显示，B细胞淋巴瘤/白血病10（BCL10）高表达是子痫前期的风险因素。BCL10是凋亡和信号转导中的关键蛋白，在多种细胞信号通路中发挥重要作用[8]。尽管已有研究揭示了BCL10在凋亡、自噬和炎症反应中的作用，但其参与子痫前期的具体机制尚不清楚。BCL10对滋养细胞功能和胎盘血管网络形成的影响有待进一步研究。通过体外构建滋养细胞衰老模型，利用BCL10过表达质粒或siRNA，我们通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色和衰老相关蛋白检测定量细胞衰老状态，通过Matrigel迁移孔实验评估细胞侵袭能力，进一步探讨BCL10的作用机制。

本研究旨在通过系统实验设计全面应用细胞分子生物学技术，明确BCL10在子痫前期胎盘滋养细胞中的表达变化，探索其与滋养细胞衰老和胎盘功能障碍的关系，为子痫前期的防治提供新靶点，改善PE患者的预后。

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**材料与方法**

**样本采集与细胞培养**

2023至2024年期间，在常州妇幼健康医院（中国江苏）于无菌条件下于剖宫产后即刻采集母体侧胎盘组织，部分迅速冷冻于-80°C保存，部分包埋制作冻切片，其余用10%福尔马林固定。本研究共纳入49例PE患者和32例正常对照。同步记录临床数据。本研究经南京医科大学常州妇幼健康医院伦理委员会批准，所有参与者均提供书面知情同意书。人滋养细胞系HTR-8/SVneo购自普罗赛斯（中国武汉），于37°C、5% CO2湿润环境中，在含10%胎牛血清（Gibco）的RPMI-1640培养基（Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）中培养。

**胎盘RNA测序数据与孟德尔随机化分析**

我们系统分析了GSE234729数据集的胎盘RNA测序数据，筛选子痫前期（PE）与正常妊娠（PC）之间的差异表达基因（DEGs）。设定log2倍值变化（logFC）≥1且P值<0.05为阈值，所得差异表达基因通过火山图和热图进行可视化，展示其分布和表达模式。进一步应用加权基因共表达网络分析（WGCNA）将差异表达基因聚类为四个模块；选择与子痫前期相关性最高的青绿色模块以鉴定核心基因。同时，从人类衰老基因组资源数据库（GenAge和CellAge数据库）及Aging Atlas数据库中收集衰老相关基因（ARGEs），去重后整合。将WGCNA获得的核心基因与衰老相关基因集取交集，确定重叠基因。对交集基因进行KEGG通路富集分析以明确其在子痫前期中的生物学功能。随后，从GTEx数据库的全血数据中检索与这些交集基因相关的表达数量性状位点（eQTLs）。经连锁不平衡过滤（P<1×10??，r2=0.01，窗口大小=1000 kb）后，对选定基因进行MR分析。逆方差加权法（IVW）或Wald比法作为主要方法，鉴定与子痫前期存在因果关系的基因以进行进一步研究。

**CCK-8细胞增殖实验**

采用CCK-8试剂盒（Beyotime，上海，中国）评估细胞增殖。具体方法为：在96孔板中每孔接种2×103个细胞，在指定时间点加入10 μl CCK-8溶液，37°C孵育2小时。以450 nm吸光度值记录活细胞数量，每个实验设三个独立重复。

**衰老相关β-半乳糖苷酶染色**

将冻切片置于空气中解冻，或去除贴壁细胞培养液后用PBS冲洗。室温下用β-半乳糖苷酶染色固定液固定15分钟，PBS再次冲洗后，加入适量染色工作液，37°C（无CO2培养箱）过夜染色（C0602，Beyotim，上海，中国）。染色后可通过光学显微镜观察，或加封片剂封片保存。

**免疫组织化学**

免疫组织化学染色步骤如下：石蜡切片脱蜡、复水并进行抗原修复。用10%山羊血清封闭后，分别用BCL10（50180-1-AP，1:400，Proteintech, Chicago, IL）和P62（18420-1-AP，1:400，Proteintech）一抗4°C过夜孵育。室温下加生物素化二抗孵育1小时。DAB显色，苏木精复染细胞核（Beyotime）。

**Western blot分析**

Western blot步骤如下：将冷冻标本或细胞于含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰上RIPA裂解液中匀浆制备组织或细胞裂解液。裂解30分钟后，4°C、12000 rpm离心15分钟，取上清液，采用BCA法（Beyotime）测定蛋白浓度。样品与5×SDS上样缓冲液混合后100°C加热10分钟，经SDS-PAGE电泳分离后转至PVDF膜。膜用5%脱脂牛奶室温封闭2小时，随后加入指示的一抗，按说明书稀释比例4°C过夜孵育。室温下加入HRP标记的二抗（SA00001-4，1:1000，Proteintech）孵育1小时，使用ECL显影液显色，数字成像系统拍照。使用ImageJ定量条带强度。每个目标蛋白条带强度以其同一样本同一转膜中β-actin（上样对照）的强度进行标准化。标准化值再相对于对照组（设为1.0）表达，每个独立实验均如此。所有Western blot均至少进行三次独立生物学重复，展示代表性图谱。

**RNA提取与qPCR分析**

按照说明书使用TRIzol试剂从细胞或组织中提取总RNA，通过NanoDrop分光光度计测定浓度和纯度。1%琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性后，取1 μg总RNA，使用PrimeScript RT Master Mix逆转录为cDNA。随后在CFX96系统上以SYBR Green法进行实时定量PCR，反应条件为：95°C预变性10分钟，然后40个循环（95°C 10秒，60°C 30秒）。熔解曲线分析确认单一产物扩增，采用2?ΔΔCt法计算相对基因表达量，以GAPDH为内参。

**细胞转染**

将HTR-8/SVneo滋养细胞接种于6孔板中，使用无抗生素完全培养基培养至BCL10过表达质粒转染所需的70-90%汇合度或BCL10 siRNA转染所需的30-50%汇合度。转染采用NanoTrans Transfection Reagent Plus（CT0005，CYTOCH），按说明书操作。质粒转染时，将2.5 μg BCL10过表达质粒或空载体对照用100 μl Opti-MEM培养基稀释，5 μl转染试剂用另一100 μl Opti-MEM培养基稀释；两者混合后室温孵育10分钟形成复合物，加入细胞中轻柔混匀。siRNA转染时，将100 pmol BCL10特异性siRNA或非靶向对照siRNA用100 μl Opti-MEM培养基稀释，转染试剂按上述相同方法稀释并复合物化。细胞与复合物共培养4-6小时后更换新鲜完全培养基。质粒转染连续培养48小时或siRNA转染培养48-96小时后，通过检测BCL10 mRNA和蛋白表达验证转染效率，转染成功的细胞用于后续实验。

**Transwell实验**

采用8 μm孔径的Transwell小室（Millipore）量化细胞侵袭。每个膜的表面上方预涂一层薄薄的Matrigel（用无血清DMEM以1:9稀释）并在室温下凝胶化。将1×10?个悬浮于200 μl无FBS DMEM中的细胞接种于上室，下室加入600 μl含10% FBS的DMEM作为趋化因子。48小时孵育后，用棉签轻轻去除膜上方未侵袭的细胞。穿越Matrigel到达背面的细胞用4%多聚甲醛固定，2%结晶紫染色，在光学显微镜（Leica, D-35578）下随机选取五个视野计数。数据以每个视野平均侵袭细胞数表示。

**划痕实验**

将处于对数生长期的目标细胞用胰蛋白酶消化，以5×10?个细胞/孔接种于6孔板中，培养至90-95%汇合度后进行2小时无血清饥饿处理；在生物安全柜中使用无菌200 μl移液器枪头垂直划痕，形成两条平行划痕（间距约0.8 cm），用预热无菌PBS冲洗2-3次，随后用含处理因子的无血清DMEM孵育，在显微镜下相同预标记视野处拍摄0小时和48小时的划痕图像。

伤口闭合率% = [(0 小时划痕宽度 – 特定时间点划痕宽度)/0 小时划痕宽度] × 100%。

转录组测序与生物信息学分析
使用 TRIzol 试剂从处理后的细胞中提取总 RNA，仅使用满足严格质量标准的样品（经 Nanodrop 分光光度计和 Agilent Bioanalyzer 评估，浓度≥50 ng/μl，RIN≥7.0，OD260/280≥1.8，总 RNA≥1 μg）；后续文库构建涉及使用 oligo (dT) 磁珠富集 PolyA+ mRNA，进行镁离子介导的断裂、逆转录和双链合成，以生成链特异性 cDNA 文库（插入片段大小 ~300 bp），然后在 Illumina NovaSeq 6000 平台上以 PE150 模式进行测序（杭州 LC-Bio Technology Co., Ltd，中国杭州）。原始 FASTQ 数据使用 fastp（默认参数）进行质量控制，以去除接头、重复和低质量读取序列；干净读取序列使用 HISAT2 比对到 Homo sapiens GRCh38 参考基因组，使用 StringTie 进行转录本组装和表达定量（FPKM），使用 R 包 edgeR 鉴定差异表达基因（DEGs），标准为|倍数变化|> 2 且 P < 0.05，并使用 DAVID 对 DEGs 进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书通路（KEGG）富集分析功能注释。

统计分析
所有细胞实验均重复三次。所有数据均以均数±标准差表示，并使用 ImageJ 1.8.0 和 GraphPad 9.5 软件进行统计分析。组间比较使用单因素或双因素方差分析以及 Student's t 检验。当双侧 P 值<0.05 时拒绝零假设，视为具有统计学意义。

结果
衰老相关基因 BCL10 和 PSMA2 是子痫前期的危险因素
对 GSE234729 的胎盘 RNA-seq 数据进行系统分析，在子痫前期（PE）和正常妊娠之间鉴定出 1488 个差异表达基因（图 1a）。对这些基因进行加权基因共表达网络分析产生了 1649 个枢纽基因（图 1b）。整合 GenAge、CellAge 和 Aging Atlas 数据库中的 1168 个衰老相关基因，并与枢纽基因交叉比较，获得 39 个重叠基因（图 1c）。通路富集显示 HIF-1、PI3K-Akt 和 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抗性通路显著参与（图 1d、e）。对五个候选基因（BCL10、DBN1、PRMT6、PSMA2、PTGES）进行孟德尔随机化分析表明，BCL10 和 PSMA2 的高表达代表 PE 的危险因素，因此将这两个基因指定为进一步研究的主要目标（图 1f）。

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图 1
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通过整合转录组学和孟德尔随机化分析鉴定与子痫前期相关的衰老相关基因。(a) 对 GSE234729 的胎盘 RNA-seq 数据进行系统分析，比较子痫前期（PE）和正常妊娠；(b) 加权基因共表达网络分析（WGCNA）；(c) 整合 GenAge、CellAge 和 Aging Atlas 数据库中与衰老相关的基因（ARGE）并与枢纽基因进行交叉比较的结果；(d) GO 分析；(E) KEGG 分析；(F) 对五个候选基因（BCL10、DBN1、PRMT6、PSMA2、PTGES）进行孟德尔随机化分析。

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通过整合转录组学和孟德尔随机化分析鉴定与子痫前期相关的衰老相关基因。(a) 对 GSE234729 的胎盘 RNA-seq 数据进行系统分析，比较子痫前期（PE）和正常妊娠；(b) 加权基因共表达网络分析（WGCNA）；(c) 整合 GenAge、CellAge 和 Aging Atlas 数据库中与衰老相关的基因（ARGE）并与枢纽基因进行交叉比较的结果；(d) GO 分析；(E) KEGG 分析；(F) 对五个候选基因（BCL10、DBN1、PRMT6、PSMA2、PTGES）进行孟德尔随机化分析。

子痫前期胎盘滋养层细胞衰老增加
与正常胎盘组织相比，子痫前期胎盘组织中 β- 半乳糖苷酶染色的阳性率显著增加（图 2a）。用不同浓度的 H2O2 刺激 3 小时后，HTR-8/SVneo 细胞的增殖呈剂量依赖性下降。在 100 μM 浓度下，滋养层细胞的增殖活性降低了 50%，因此选择该浓度建立 PE 模型（图 2b）。当用 100 μM H2O2 处理滋养层细胞 HTR-8/SVneo 3 小时时，β- 半乳糖苷酶染色的阳性率也显著增加（图 2c），表明子痫前期胎盘滋养层细胞显著衰老。

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图 2
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子痫前期胎盘滋养层细胞衰老增加。(a) 正常组（n = 5）和子痫前期组（n = 5）胎盘组织的衰老相关 β- 半乳糖苷酶染色；(b) 使用 CCK8 检测不同浓度 H2O2 刺激 3 小时后 HTR-8/SVneo 细胞的细胞活力（每浓度 n = 3）；(c) 100 μM H2O2 刺激的 HTR-8/SVneo 细胞的衰老相关 β- 半乳糖苷酶染色（每组 n = 3）（20×）。ns，无差异，*P < 0.05，**P < 0.01。

BCL10 在子痫前期患者胎盘中高表达
免疫印迹分析显示，在子痫前期组织中，BCL10、P62 和 MMP3 的表达显著高于正常组织，而 PSMA2 无差异（图 3a）。PCR 检测显示，在子痫前期组织中，BCL10 和 P62 高于正常组织，PSMA2 也无差异（图 3b）。免疫组化进一步证实 BCL10 在子痫前期组织中上调（图 3c）。对临床数据的进一步分析显示，与正常妊娠组相比，PE 女性分娩时 BMI 显著更大，孕周更短，孕次更高，且循环中的血小板、白蛋白、腺苷脱氨酶（ADA）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、乳酸脱氢酶（LDH）和三氧嘌呤水平升高（所有 P < 0.05）。与此同时，PE 组的新生儿出生体重以及 1 分钟和 5 分钟 Apgar 评分明显降低（P < 0.001）。两组之间在母亲年龄、D- 二聚体、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血脂谱或婴儿性别方面无统计学显著差异（所有 P > 0.05）（表 1）。较高的 BCL10 表达与分娩时 BMI 增加显著相关（P = 0.026）。高表达组和低表达组之间在母亲年龄、分娩孕周、收缩压或舒张压、24 小时蛋白尿、新生儿出生体重或 1 分钟和 5 分钟 Apgar 评分方面无显著差异（所有 P > 0.05）（表 2）。免疫印迹分析显示，与正常组相比，子痫前期组中 BCL10 和衰老相关蛋白 P53、P21 和 P16 的表达增加，而 Lamin B1 的表达降低（图 3d）。同时，在用 100 μM H2O2 处理 3 小时建立的 PE 细胞模型 HTR-8/SVneo 滋养层细胞中，也观察到 BCL10 上调，伴随衰老相关蛋白 P53、P21 和 P16 表达升高以及 Lamin B1 水平降低，与临床样本中的发现一致（图 3e）。

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图 3
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BCL10 在子痫前期患者胎盘中高表达。(a) 正常组（n = 5）和子痫前期组（n = 5）胎盘组织中 BCL10、P62、MMP3 和 PSMA2 的免疫印迹分析；(b) 正常组（n = 5）和子痫前期组（n = 5）胎盘组织中 BCL10、P62 和 PSMA2 的定量实时 PCR 分析；(c) 胎盘组织（n = 49）和正常组织（n = 32）中 BCL10 的免疫组化结果（放大倍数：10×，比例尺：200 μm；40×，比例尺：50 μm）；(d) 正常组（n = 3）和子痫前期组（n = 3）胎盘组织中 BCL10 和衰老相关蛋白（P53、P21、P16、Lmnab1）的免疫印迹分析；(e) 100 μM H2O2 刺激的 HTR-8/SVneo 细胞中 BCL10 和衰老相关蛋白（P53、P21、P16、Lmnab1）的免疫印迹分析（每组 n = 3）。ns，无差异，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

表 1 正常患者和 PE 患者一般数据比较
组别 正常 PE P 值
年龄，岁（均数±SD） 31.13 ± 3.96 30.65 ± 4.80 0.645
分娩时 BMI，kg/m2（均数±SD） 28.31 ± 2.83 30.25 ± 3.95 0.018a
分娩天数，周（均数±SD） 38.95 ± 0.74 35.53 ± 3.59 0.000c
孕次 2.84 ± 1.37 2.14 ± 1.59 0.045a
产次 1.81 ± 0.74 1.43 ± 0.71 0.021a
血小板（×10^9/L） 193.81 ± 67.42 197.20 ± 55.34 0.805
HB（ug/l） 113.81 ± 12.90 118.39 ± 14.18 0.145
D- 二聚体（mg/l） 0.57 ± 0.22 0.52 ± 0.36 0.479
TP（g/l） 60.09 ± 3.57 58.79 ± 4.80 0.167
白蛋白（g/l） 33.25 ± 1.81 31.63 ± 3.36 0.006b
ADA（U/l） 9.07 ± 2.51 12.78 ± 2.06 0.000c
TBA（umol/l） 4.61 ± 2.18 6.42 ± 3.94 0.078
ALT（U/l） 14.38 ± 14.84 23.52 ± 29.49 0.109
AST（U/l） 18.78 ± 8.80 30.12 ± 28.20 0.011a
ALP（U/l） 172.84 ± 49.74 172.64 ± 76.18 0.990
Trioxypurine（umol/l） 289.26 ± 70.78 395.15 ± 122.10 0.000c
BUN（mmol/l） 3.50 ± 0.92 4.47 ± 2.00 0.004b
Cr（umol/l） 45.16 ± 6.91 56.02 ± 23.19 0.003b
LDH（U/l） 174.28 ± 35.29 222.80 ± 75.89 0.000c
TG（mmol/l） 6.29 ± 1.18 6.17 ± 1.20 0.657
TC（mmol/l） 3.35 ± 1.00 3.83 ± 1.67 0.144
HDL（mmol/l） 1.97 ± 0.38 1.89 ± 0.35 0.327
LDL（mmol/l） 3.71 ± 0.69 3.62 ± 0.89 0.653
出生体重，g（均数±SD） 3347.19 ± 339.84 2347.61 ± 925.09 0.000c
新生儿性别 0.517
男孩 15 24
女孩 17 25
Apgar 评分
1 分钟 9.97 ± 0.18 9.29 ± 0.82 0.000c
5 分钟 10.00 ± 0.00 9.37 ± 0.78 0.000c
ADA，腺苷脱氨酶；ALP，碱性磷酸酶；ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天门冬氨酸转氨酶；BMI，身体质量指数；BUN，血尿素氮；Cr，肌酐；HB，血红蛋白；HDL，高密度脂蛋白；LDH，乳酸脱氢酶；LDL，低密度脂蛋白；PE，子痫前期；TBA，总胆汁酸；TC，甘油三酯；TG，甘油三酯；TP，总蛋白。
aP < 0.05。
bP < 0.01。
cP < 0.001。

表 2 BCL-10 与 PE 患者临床数据的关系
特征 BCL-10 表达 P 值
低 高
年龄，岁（均数±SD） 30.32 ± 4.95 30.87 ± 4.78 0.700
分娩时 BMI，kg/m2（均数±SD） 28.85 ± 2.53 31.14 ± 4.44 0.026a
分娩天数，周（均数±SD） 36.25 ± 2.69 35.07 ± 4.04 0.229
收缩压（mmHg） 143.00 ± 5.18 147.00 ± 12.41 0.128
舒张压（mmHg） 91.42 ± 9.57 94.57 ± 10.38 0.292
24 小时蛋白尿（g/l） 0.95 ± 0.94 0.91 ± 2.33 0.712
出生体重，g（均数±SD） 2495.79 ± 796.57 2253.77 ± 999.57 0.378
Apgar 评分
1 分钟 9.32 ± 0.75 9.27 ± 0.88 0.840
5 分钟 9.37 ± 0.76 9.37 ± 0.81 0.994
aP < 0.05。

BCL10 诱导滋养层细胞衰老并抑制侵袭和迁移
为了阐明 BCL10 对滋养层衰老和侵袭的影响，我们转染了 BCL10 过表达质粒和特异性 siRNA 的 HTR-8/SVneo 细胞。通过 PCR 和 WB 验证转染效率，确定 siRNA2 具有最高的干扰效率用于后续实验（图 4a、b）。免疫印迹分析揭示，BCL10 过表达显著上调 P53、P21 和 P16 的表达，同时降低 Lamin B1 水平；相反，BCL10 沉默产生相反的表达谱，证实了观察到的效应的特异性。免疫印迹分析揭示，BCL10 过表达显著上调衰老相关蛋白 P53、P21 和 P16，同时降低 Lamin B1 水平；相反，BCL10 沉默产生相反的表达谱（图 4c）。BCL10 过表达在 HTR-8/SVneo 滋养层细胞中引发明显的细胞衰老，而 BCL10 沉默显著减弱衰老表型（图 4d）。Matrigel 体外侵袭实验显示，BCL10 过表达显著抑制 HTR-8/SVneo 细胞的侵袭。同时，划痕实验显示，在划痕 48 小时后，BCL10 过表达可显著抑制 HTR-8/SVneo 细胞的迁移；而干扰 BCL10 显著促进 HTR-8/SVneo 细胞的侵袭和迁移（图 4e、f）。结果共同表明，BCL10 可能通过促进滋养层细胞衰老并在导致侵袭和迁移不足从而在子痫前期发展中起关键作用。

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图 4
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BCL10 诱导滋养层细胞衰老并抑制侵袭。(a) 转染表达人 BCL10 的质粒 DNA 或特异性 siRNA 的 HTR-8/SVneo 细胞中 BCL10 的 qRT-PCR 分析；(b) 过表达或敲低后 BCL10 的免疫印迹分析；(c) 转染 BCL10 质粒 DNA 或特异性 siRNA2 的 HTR-8/SVneo 细胞中衰老相关蛋白（P53、P21、P16、Lmnab1）的免疫印迹分析；(d) 衰老相关 β- 半乳糖苷酶染色结果；(e) 转染 BCL10 质粒 DNA 或特异性 siRNA2 后 HTR-8/SVneo 细胞的侵袭；(f) 转染 BCL10 质粒 DNA 或特异性 siRNA2 后 HTR-8/SVneo 细胞的 transwell 实验。每组 n = 3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

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图 4 续。
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BCL10 诱导滋养层细胞衰老并抑制侵袭。(a) 转染表达人 BCL10 的质粒 DNA 或特异性 siRNA 的 HTR-8/SVneo 细胞中 BCL10 的 qRT-PCR 分析；(b) 过表达或敲低后 BCL10 的免疫印迹分析；(c) 转染 BCL10 质粒 DNA 或特异性 siRNA2 的 HTR-8/SVneo 细胞中衰老相关蛋白（P53、P21、P16、Lmnab1）的免疫印迹分析；(d) 衰老相关 β- 半乳糖苷酶染色结果；(e) 转染 BCL10 质粒 DNA 或特异性 siRNA2 后 HTR-8/SVneo 细胞的侵袭；(f) 转染 BCL10 质粒 DNA 或特异性 siRNA2 后 HTR-8/SVneo 细胞的 transwell 实验。每组 n = 3。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

基因表达谱
为了阐明 BCL10 在 PE 相关滋养层细胞衰老中的作用，我们对 HTR-8/SVneo 细胞中 BCL10 沉默进行了转录组分析（图 5a）。干扰 BCL10 后，总共 356 个差异表达基因表达增加，而 366 个表达降低（图 5b）。基因本体（GO）富集分析揭示，这些差异基因主要富集在包括免疫炎症反应、转录和基因表达调节、细胞增殖和凋亡、信号转导以及脂质代谢等生物过程；细胞膜、细胞核和线粒体等细胞成分；以及涉及蛋白结合、酶活性和核酸结合的分子功能中（图 5c）。KEGG 通路富集分析显示，差异基因主要涉及包括 NOD 样受体、胞质 DNA 感应、NF-κB 和 C 型凝集素受体通路在内的免疫相关信号通路，并富集在细胞因子 - 细胞因子受体相互作用、中性粒细胞细胞外诱捕网形成、炎症介质对 TRP 通道的调节、细胞骨架调节、脂质和动脉粥样硬化以及多种病原体感染相关通路中（图 5d）。

这些发现共同表明，BCL10可能通过调节免疫炎症反应、细胞增殖和凋亡以及相关的信号通路，参与子痫前期滋养细胞衰老的调控。

打开多媒体模式 图5 打开多媒体模式 BCL10介导的基因表达谱分析。(a) HTR-8/Svneo细胞转染siBCL10（n = 3）和siCrl（n = 3）后的差异表达基因（DEGs）聚类热图；(B) DEGs火山图；(c) 基因本体（GO）分析显示，siCon或siBCL10处理的HTR-8/SVneo细胞中所有表达改变的基因在生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）方面存在富集；(d) 京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。

打开多媒体模式 图5（续）。打开多媒体模式 BCL10介导的基因表达谱分析。(a) HTR-8/Svneo细胞转染siBCL10（n = 3）和siCrl（n = 3）后的差异表达基因（DEGs）聚类热图；(B) DEGs火山图；(c) 基因本体（GO）分析显示，siCon或siBCL10处理的HTR-8/SVneo细胞中所有表达改变的基因在生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）方面存在富集；(d) 京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。

讨论

子痫前期仍然是导致母婴发病率和死亡率的主要原因，但其分子基础，特别是与胎盘衰老相关的机制，尚未被完全理解[9]。在本研究中，我们整合了转录组学分析、孟德尔随机化和体外功能实验，鉴定出BCL10是驱动子痫前期滋养细胞衰老的一个新的因果基因。我们的广泛发现表明，BCL10在子痫前期胎盘中上调，并且在过氧化氢诱导的滋养细胞衰老模型中上调；其过表达促进衰老并抑制滋养细胞侵袭和迁移。相反，BCL10沉默则逆转了这些表型。转录组谱分析进一步揭示，BCL10调节免疫炎症通路，包括NF-κB和NOD样受体信号通路，为其在子痫前期发病机制中的作用提供了机制性见解。

BCL10作为滋养细胞中促衰老因素的鉴定，与将免疫失调与胎盘衰老联系起来的新兴证据相一致[10]。BCL10是含CARD结构域信号复合物中一种已知的接头蛋白[11]，在抗原受体刺激和病原体识别应答中介导NF-κB激活[12,13]。然而，其在子痫前期中的作用此前尚未报道。我们的MR分析利用GTEx的eQTL数据，提供了遗传学证据支持BCL10表达升高与子痫前期风险增加之间的因果关系，增强了我们发现的转化相关性。

从机制上看，BCL10在HTR-8/SVneo细胞中的敲低导致差异表达的基因富集于免疫炎症反应、凋亡以及NF-κB和NOD样受体信号通路。这些通路已知在子痫前期中被激活，并参与氧化应激、内皮功能障碍和胎盘衰老[14]。在受到刺激后，BCL10与MALT1形成复合物，导致IKK磷酸化及随后的NF-κB核转位，从而驱动促炎细胞因子和抗凋亡因子的转录[15]。在子痫前期的背景下，该通路的异常激活可能促成了该疾病特征性的过度炎症反应[16]。特别是NOD样受体通路，已被发现在子痫前期胎盘的无菌性炎症和炎性体激活中发挥作用[17]。在滋养细胞中，NOD样受体感知在氧化应激和缺氧下释放的危险信号——这正是子痫前期的标志性特征——从而触发炎性体形成并分泌IL-1β和IL-18，传播炎症并诱导细胞衰老[18]。我们的数据表明，BCL10可能作为一个整合节点，将炎症应激与细胞衰老以及滋养细胞功能障碍联系起来。

在功能上，我们观察到BCL10过表达上调了P53/P21/P16的表达并降低了Lamin B1——这些是细胞衰老的标志物——同时抑制滋养细胞侵袭和迁移。这些效应在BCL10沉默后被逆转。这与研究表明滋养细胞中衰老程序的激活会损害其侵袭能力——这是子痫前期的一个关键病理特征——的结果一致。值得注意的是，衰老相关分泌表型（SASP）可以将炎症信号传播至邻近细胞，从而加重胎盘功能障碍[19]。因此，BCL10不仅可能驱动滋养细胞的内在老化，还可能通过调节衰老相关分泌表型促成促炎微环境的形成。

与MR发现一致，临床胎盘组织验证显示，与正常妊娠相比，BCL10在子痫前期患者中的mRNA和蛋白水平均显著上调，并伴随衰老标志物P62和MMP3的升高。虽然MR分析还将蛋白酶体20S亚单位Alpha 2（PSMA2）鉴定为潜在风险基因，但随后在子痫前期胎盘组织中的验证显示，PSMA2在子痫前期和正常对照之间的mRNA或蛋白水平均无显著差异。这一差异可能源于全血eQTL的使用，后者可能无法反映胎盘特异性调控。同时，这一差异凸显了基于MR的靶点优先筛选中的一个重要考量：遗传工具反映的是终身暴露效应，可能通过不同组织、发育阶段或代偿机制介导，而这些并未被足月胎盘样本所捕捉[20]。PSMA2作为一种蛋白酶体亚单位[21]，可能通过胎盘外组织（如母体内皮细胞或免疫细胞）或在我们队列中未体现的更早妊娠阶段对子痫前期风险产生作用。相比之下，BCL10在遗传预测和表达水平上均表现出一致的上调，支持其在胎盘滋养细胞生物学中的直接且细胞类型特异性的作用。BCL10在子痫前期胎盘中的表达与分娩时BMI（子痫前期已知风险因素）呈正相关，并与升高的衰老标志物P62和MMP3相关。这些观察结果与将母体代谢状态与胎盘炎症和衰老联系起来的报道一致[22]。MR优先筛选基因（BCL10和PSMA2）与实验验证结果（仅BCL10）之间的差异既突显了MR在药物靶点发现中的优势，也凸显了其局限性。MR提供了终身遗传效应对疾病风险影响的证据，这些效应可能通过多种组织、发育窗口或间接机制发挥[23]。BCL10在遗传预测、胎盘表达和功能检测中均显示出一致信号，支持其作为子痫前期病理中滋养细胞内在驱动因子的作用。这一整合方法——结合MR进行因果优先筛选、临床验证确定组织特异性相关性以及功能检测提供机制性见解——可以为在复杂妊娠疾病中识别和验证治疗靶点提供一个稳健的框架[24]。

尽管有这些发现，我们的研究存在若干局限性。首先，我们承认所有功能实验仅使用了HTR-8/SVneo细胞系，该细胞系不能完全代表胎盘微环境的异质性细胞组成。这种永生化第一孕期绒毛外滋养细胞细胞系缺乏对胎盘功能至关重要的其他滋养细胞亚型以及基质细胞、免疫细胞和内皮细胞。此外，其第一孕期的来源可能限制了向足月子痫前期病理生理的直接外推。未来采用原代滋养细胞培养、胎盘组织切片、共培养模型和体内方法的研究是必要的，以进一步验证BCL10在子痫前期中的作用。此外，H?O?主要反映急性应激诱导的衰老反应，可能无法完全反映慢性胎盘衰老过程中存在的累积损伤、适应机制或多细胞相互作用。尽管如此，我们的体外结果与子痫前期胎盘组织中观察到的表达模式之间的一致性，支持了BCL10-衰老轴与该临床状况的相关性。此外，BCL10诱导滋养细胞衰老并损害胎盘功能的具体分子机制仍有待阐明。我们的转录组数据表明BCL10可能在将炎症应激与滋养细胞衰老联系起来中发挥作用，通路富集指向NF-κB和NOD样受体信号通路。然而，由于这些通路关联源于生物信息学分析而非直接功能检测，该机制模型仍属初步阶段，需要未来研究中的实验验证（如测量NF-κB核转位、IKK磷酸化或炎性体激活）。具体而言，我们承认全血eQTL可能无法完全捕捉组织特异性调控效应，因此未来需要使用胎盘特异性eQTL数据的研究。未来使用长期缺氧、持续炎症细胞因子暴露、更大患者队列、多种细胞类型和动物模型的研究对于确认BCL10在子痫前期中的功能作用，以及确定其是否以类似方式参与慢性胎盘衰老的长期进展至关重要。

总之，通过整合基因组分析和实验验证，我们揭示了BCL10是推动子痫前期滋养细胞衰老并损害滋养细胞侵袭和迁移功能的关键因素。BCL10可能通过调节免疫炎症反应——特别是通过NF-κB和NOD样受体信号通路——促进子痫前期中的滋养细胞衰老。未来研究应致力于深入探讨BCL10调控滋养细胞生物学的机制，并探索其在减轻子痫前期相关并发症中的转化潜力。

致谢

资金：本工作由常州卫健委高层次人才项目[2022CZLJ023]、常州科技计划[CJ20260776, CJ20245042, CJ20220117]和常州市卫健委青年项目[QN202374]资助。

知情同意：已从所有纳入研究的个体参与者获得知情同意。

伦理委员会批准：所有工作均符合《赫尔辛基宣言》。实验在每位参与者理解和同意的情况下进行，常州母婴保健医院负责的伦理委员会（IRB编号：2025-K015-01）批准了这些实验。

利益冲突：不存在利益冲突。