《Frontiers in Molecular Neuroscience》：DNA methylation and proteomic profiling of postmortem brain tissue reveals epigenetic dysregulation and inflammatory signaling in fragile X-associated tremor/ataxia syndrome
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专业翻译摘要：
脆性X相关震颤/共济失调综合征（FXTAS）是一种由FMR1基因前突变（premutation）范围CGG重复扩增引起的晚发性神经退行性疾病。目前对FXTAS脑组织的表观遗传景观了解甚少。研究人员对死后前额叶皮层进行了全基因组DNA甲基化谱
专业翻译摘要：
脆性X相关震颤/共济失调综合征（FXTAS）是一种由FMR1基因前突变（premutation）范围CGG重复扩增引起的晚发性神经退行性疾病。目前对FXTAS脑组织的表观遗传景观了解甚少。研究人员对死后前额叶皮层进行了全基因组DNA甲基化谱分析及靶向蛋白质组学分析，以探究与FXTAS相关的分子改变并评估炎症信号通路的趋同变化。方法上，研究人员使用Illumina MethylationEPIC芯片对27例男性FXTAS病例和29例男性对照的死后前额叶皮层DNA甲基化进行了分析，并采用替代变量分析（surrogate variable analysis, SVA）校正潜在变异来源；鉴定了差异甲基化位点（differentially methylated positions, DMPs）和差异甲基化区域（differentially methylated regions, DMRs）；进行了探索性功能分析，并与已发表的FXTAS转录组及神经退行性疾病甲基化数据集进行比较；同时使用Olink炎症panel对9例男性FXTAS病例和12例男性对照进行了靶向蛋白质组学分析。结果共鉴定出98个DMP，映射至70个基因，其中值得关注的DMP相关基因包括与氧化应激相关的CYP2E1；参与免疫及NF-κB信号调控的TRAF3、BATF、RCOR1和MSI2；以及与髓鞘形成（LINGO1）、突触功能（SYT3）和锌稳态（SLC39A4）相关的基因。TRAF3是NF-κB和I型干扰素信号的负调控因子，其含有一个最显著的DMP。探索性Reactome分析强调了炎症消退、轴突生长抑制、锌稳态和CYP2E1代谢等生物学主题，但经多重检验校正后均未保持显著。转录因子基序富集和蛋白质-蛋白质相互作用分析未发现显著的高阶调控或互作模块。7个DMP相关基因与一项独立FXTAS小鼠转录组研究中的差异表达基因重叠，但与所检测的阿尔茨海默病、帕金森病或亨廷顿病甲基化特征未见基因水平重叠。Olink分析共鉴定60个显著改变的炎症相关蛋白，其中59个在FXTAS中呈较低丰度，包括TLR3、IRAK1、IRAK4、IKBKG/NEMO和C1QA。结论：这些发现揭示了FXTAS前额叶皮层中此前未被识别的DNA甲基化改变，涉及氧化应激、髓鞘形成、锌稳态以及先天免疫/NF-κB信号相关基因。甲基化改变（包括TRAF3）与整体降低的炎症蛋白特征之间的趋同性，为FXTAS中炎症信号通路改变提供了互补证据。
论文解读文章：
脆性X相关震颤/共济失调综合征（FXTAS）是一种由脆性X信使核糖核蛋白1基因（FMR1）前突变等位基因（55–200个CGG重复）引起的晚发性进行性神经退行性疾病，主要影响男性，50岁以上男性前突变携带者的外显率约为40%，80岁以上可达75%。其神经病理学标志为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞中广泛存在的泛素阳性核内包涵体。FXTAS的经典致病机制涉及前突变等位基因仍保持转录活性，产生含CGG重复的mRNA，该mRNA可螯合RNA结合蛋白（RBPs）并通过重复相关非AUG（RAN）翻译产生含多聚甘氨酸的毒性蛋白。既往针对FXTAS的甲基化研究多集中于血液来源DNA或仅检测FMR1位点，对FXTAS大脑整体的表观遗传景观缺乏系统表征。
为填补这一空白，研究人员开展了首项针对FXTAS死后前额叶皮层的全基因组DNA甲基化分析，并整合靶向炎症蛋白质组学数据，以期鉴定与FXTAS相关的分子改变及炎症信号通路的趋同变化。研究人员利用Illumina MethylationEPIC芯片对27例男性FXTAS病例和29例男性对照的死后前额叶皮层（Brodmann 9区）样本进行全基因组DNA甲基化谱分析，并使用Olink炎症panel对其中9例FXTAS和12例对照进行靶向蛋白质组学分析。甲基化数据分析采用SeSAMe流程进行预处理与质量控制，合并EPICv1和EPICv2两平台共718,960个CpG探针，通过替代变量分析（SVA）校正潜在变异来源，以FXTAS诊断为主要变量并纳入五个替代变量作为协变量进行差异甲基化分析。差异甲基化位点（DMP）定义为绝对甲基化差异|Δβ|>0.10且Benjamini–Hochberg校正后p值<0.05的CpG探针。蛋白质组学数据同样应用SVA，保留两个显著替代变量，以线性回归评估差异蛋白丰度，FDR<0.05为显著阈值。此外，研究人员还进行了Reactome通路富集、g:Profiler功能注释、HOMER和JASPAR转录因子基序富集分析、STRING蛋白-蛋白质相互作用网络分析，以及外部数据集重叠分析。
研究发现，共鉴定出98个显著DMP，包括48个高甲基化位点（Δβ范围+0.100至+0.241）和50个低甲基化位点（Δβ范围?0.100至?0.229），映射至70个基因。甲基化改变涉及多个生物学主题，其中与氧化应激相关的CYP2E1携带三个低甲基化探针，所有探针方向一致；与先天免疫和NF-κB信号相关的基因中，负调控因子TRAF3含有一个最显著的DMP且呈高甲基化，而CLEC1A亦高甲基化，但RHBDF2/iRhom2、MEIS1和ELMO3则呈低甲基化；与髓鞘形成相关的LINGO1呈低甲基化；锌稳态相关基因SLC39A4和ZIC1亦呈低甲基化。DMP在CpG岛及 shores 的比例高于背景分布（62%对37%），提示这些差异甲基化位点具有潜在调控意义。FMR1位点未检测到大效应甲基化改变，与前突变状态通常保持启动子非甲基化的特征一致。
在通路分析中，Reactome探索性分析虽无通路经多重检验校正后仍显著，但名义显著的通路可归为几类生物学主题：炎症相关及促消退介质生物合成、轴突生长抑制、氧化应激与CYP2E1代谢、锌稳态、N-糖蛋白加工及DNA完整性检查点。g:Profiler分析经g:SCS校正后仍有31个显著条目，主要富集于转录因子结合基序基因集和miRNA靶基因集，其中miR-342与TNF-α诱导的小胶质细胞激活和NF-κB信号相关。转录因子基序富集分析中，HOMER和JASPAR库均无基序在多重校正后显著，但两库中AP-1/bZIP家族基序（如ATF1、JUN/AP-1、BACH1、FOSL1等）均反复出现在名义显著前列。STRING蛋白-蛋白质相互作用网络仅鉴定出少数稀疏互作，未形成与先天免疫/NF-κB信号对应的显著模块。
外部数据集比较显示，本研究DMP相关基因中有7个（DGKQ、ELMO3、LRIG1、LTBP4、MEIS1、PAQR4和ZIC1）与一项独立FXTAS小鼠多组学研究中的差异表达基因重叠，且这些基因被报道为hnRNPA2B1的直接靶标，并在FXTAS模式小鼠的GABA能神经元中表达改变。然而，FXTAS的DMP相关基因与阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病的大脑甲基化特征在基因水平上无重叠。
Olink靶向蛋白质组学分析共鉴定60个显著改变的炎症相关蛋白，其中59个在FXTAS中呈较低丰度，仅1个呈较高丰度。降低的蛋白包括促炎趋化因子（CXCL8/IL-8、CXCL10/IP-10、CXCL1、CCL7、CCL23）、白细胞介素及其受体（IL6、IL7、IL15、IL17D、IL18、IL1R2、IL18R1）、先天免疫及NF-κB信号组分（TLR3、IRAK1、IRAK4、IKBKG/NEMO、TRIM21）、补体经典通路成分C1QA、小胶质细胞受体（SIGLEC1、SIGLEC10）以及神经营养因子FGF2。质量控制分析表明，这一普遍降低的蛋白信号并非由测序深度或归一化流程所致。与既往基于质谱的FXTAS皮层蛋白质组研究相比，两个平台共同检测到的19种蛋白中有13种（68%）方向一致，包括IRAK1、IKBKG/NEMO和PARP1，支持了不同蛋白质组学技术间共同观察到的FXTAS皮层炎症相关蛋白丰度降低这一总体发现。
讨论中，研究人员指出，CGG重复RNA毒性可能导致RNA结合蛋白和染色质相关蛋白被螯合，进而引起位点特异性低甲基化。CYP2E1低甲基化若伴随表达升高，可能通过产生活性氧（ROS）激活NF-κB信号，并干扰DHA来源的促消退介质合成，损害神经炎症消退过程。TRAF3高甲基化若导致其表达下降，可能削弱其对非经典NF-κB和I型干扰素信号的负调控，从而使促炎信号增强。结合蛋白水平上NF-κB通路组分（TLR3、IRAK1、IRAK4、IKBKG/NEMO）及补体成分C1QA的广泛下降，研究人员假设FXTAS大脑可能处于一种慢性参与但失调或消退不充分的免疫状态。LINGO1低甲基化可能与其抑制少突胶质细胞分化及髓鞘再生的功能相关，为FXTAS白质病变提供潜在机制联系。锌稳态相关基因的甲基化改变则与FMRP功能下降对锌转运蛋白翻译调控的影响产生关联。此外，尽管多个DMP相关基因在功能上与其它神经退行性疾病重叠，但与AD、PD、HD的甲基化特征无基因水平重叠，说明FXTAS表观遗传特征可能部分独立。
研究结论指出，该研究提供了首份FXTAS死后前额叶皮层的全基因组DNA甲基化图谱，鉴定出98个跨70个基因的显著CpG DMP，揭示了FMR1位点之外的表观遗传改变，并提名了涉及氧化应激（CYP2E1）、髓鞘形成（LINGO1）、锌稳态（SLC39A4、ZIC1/4）、突触功能（SYT3）、染色质调控（RCOR1、TADA2A）以及该数据集中最突出的先天免疫/NF-κB信号（TRAF3、RCOR1、MSI2）的候选基因变化。TRAF3高甲基化（本研究最显著的DMP之一）与多个先天免疫和NF-κB相关蛋白（如TLR3、IRAK1、IRAK4和补体C1QA）丰度降低共同为FXTAS皮层中炎症信号通路改变提供了趋同证据。其中，免疫调节基因甲基化改变与整体降低的炎症蛋白特征之间的趋同性，是特别值得关注的发现，需进一步研究加以验证。未来研究应整合FXTAS脑组织的甲基化、转录组、蛋白质组和代谢组分析，并在前突变携带者中进行纵向表观全基因组研究以及候选基因的直接功能验证，以明确这些发现的生物学意义及其作为生物标志物和治疗靶点的潜在价值。
