《Frontiers in Immunology》：Preliminary analysis of the proportions and characteristics of dual TCR T cells and dual BCR B cells in echinococcus granulosus-infected mice using scRNA+TCR+BCR-seq
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摘要专业翻译
引言： 囊型棘球蚴病（CE）是一种由细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus）引起的人畜共患寄生虫病，CE中T细胞和B细胞的应答及调控机制尚不明确。
方法： 本研究通过单细胞RNA+TCR+BCR测序（scRNA+TCR+BCR
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引言： 囊型棘球蚴病（CE）是一种由细粒棘球蚴（Echinococcus granulosus）引起的人畜共患寄生虫病，CE中T细胞和B细胞的应答及调控机制尚不明确。
方法： 本研究通过单细胞RNA+TCR+BCR测序（scRNA+TCR+BCR-seq）分析了感染细粒棘球蚴（EG）小鼠的外周血和脾脏数据。
结果： 研究人员获得以下新发现：（1）EG感染小鼠外周血中双TCR（T细胞受体）T细胞的比例高于未感染小鼠，且克隆性更高；（2）EG感染小鼠中，单TCR T细胞与双TCR T细胞之间、以及单BCR（B细胞受体）B细胞与双BCR B细胞之间，V基因使用存在偏倚；（3）EG感染小鼠中，双TCR调节性T细胞（Treg）、双TCR效应CD8 T细胞、双BCR调节性B细胞（Breg）以及双BCR记忆/分裂B细胞表现出相对较高的克隆扩增；（4）EG感染小鼠中，单受体T/B细胞与双受体T/B细胞之间存在共享的CDR3序列和持续高表达的mRNA分子。KEGG富集分析显示，双BCR B细胞与“Th1/Th2分化”和“抗原加工与呈递”等通路相关因子的表达密切相关。
讨论： 这些结果表明，双TCR T细胞和双BCR B细胞可能参与EG感染小鼠的特异性应答与调控，为寄生虫感染的适应性免疫应答机制和靶向治疗提供了新的视角。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
囊型棘球蚴病（CE）是由细粒棘球蚴（EG）感染引起的人畜共患寄生虫病，被世界卫生组织列为重点关注的17种被忽视热带病之一，全球感染人数超过一百万。CE可损害人体多个器官，通常为终身性疾病，威胁生命且难以防控和治疗，每年造成的经济损失超过30亿美元，已成为全球性公共卫生问题。然而，CE中T细胞和B细胞的特异性免疫应答及调控机制尚未完全阐明。尽管疫苗研究已取得一定进展，但潜在有效的治疗药物仍在等待临床试验验证。
在EG感染小鼠模型中，免疫应答呈现动态演变：早期（约第一个月）以产生IFN-γ的Th1型应答为主，可能对原头蚴存活提供部分保护；随着感染进展至慢性/晚期（约3个月及以后），免疫应答转向以IL-4和IL-10升高为特征的Th2型为主，伴随Treg、Breg和髓源性抑制细胞（MDSCs）的扩增，使寄生虫得以长期存活。本研究选取的22周时间点即代表这一已充分建立的晚期/慢性阶段。
经典的克隆选择学说认为“一个淋巴细胞仅表达一种抗原受体”，但该理论已被“双TCR T细胞和双BCR B细胞”的存在所挑战和补充。自1988年首次在mRNA水平检测到单个T细胞中存在两个功能性Vα和Vβ基因重排以来，多个实验室已确认双TCR T细胞和双BCR B细胞的存在。近年来已证实，双TCR T细胞和双BCR B细胞与肿瘤、感染和自身免疫性疾病的发生发展密切相关。然而，寄生虫的抗原表位和毒力因子不同于细菌和病毒，迄今为止尚无关于寄生虫感染后双受体淋巴细胞的研究报道。因此，本研究利用共享的scRNA+TCR+BCR-seq数据，对EG感染小鼠中双TCR T细胞和双BCR B细胞进行详细的比较分析，以探究其是否参与寄生虫感染的免疫应答与调控。
二、研究内容与主要结论
研究人员对EG感染小鼠（IP组：感染外周血；IS组：感染脾脏）和未感染小鼠（UP组：未感染外周血；US组：未感染脾脏）的共享单细胞测序数据进行了系统的比较分析，创新性地发现双TCR T细胞和双BCR B细胞可能参与EG感染小鼠的免疫应答与调控，为寄生虫感染的适应性免疫应答机制和靶向治疗提供了新视角。具体而言：EG感染小鼠外周血中双TCR T细胞比例（15.32%）显著高于未感染小鼠（7.89%），且克隆性更高；双TCR Treg、双TCR效应CD8 T细胞、双BCR Breg和双BCR记忆/分裂B细胞在EG感染小鼠中表现出相对较高的克隆扩增；单受体与双受体T/B细胞之间存在共享CDR3序列和一致高表达的mRNA分子，提示二者针对相同抗原表位发挥作用。
三、关键技术方法
本研究主要采用以下关键技术方法：（1）单细胞RNA+TCR+BCR测序（scRNA+TCR+BCR-seq）技术，样本来源于Wu J等人发表论文（Infection and Immunity, 2023, doi:10.1128/iai.00029-23）所共享的GEO数据库数据（GSE216347和GSE225312），包括6-8周龄雌性BALB/c小鼠（EG感染组n=3，未感染对照组n=3），于感染后22周采集外周血和脾脏；（2）使用R包immunarch进行CDR3库特征分析，包括克隆性比较、V基因使用偏倚分析和CDR3重叠分析；（3）使用harmonyR包进行样本整合，DoubletFinder包去除双细胞，Seurat包进行标准化、降维聚类和细胞亚群注释；（4）通过每个细胞独特的barcode整合scRNA-seq与scTCR+BCR-seq数据进行联合分析；（5）使用SPSS 26进行统计学分析，采用Pearson卡方检验或Fisher精确检验。
四、研究结果
4.1 双TCR T细胞和双BCR B细胞的比例及配对特征
通过scTCR-seq和scBCR-seq数据分析，在EG感染小鼠的脾脏和外周血中均鉴定出双TCR T细胞和双BCR B细胞。EG感染小鼠外周血和脾脏中双BCR B细胞比例分别为13.03%和15.88%，主要配对类型为H+κ1+κ2（外周血6.71%；脾脏7.81%）。双TCR T细胞在外周血和脾脏中的比例分别为15.32%和12.42%，主要配对类型为α1+α2+β（外周血8.00%；脾脏9.26%）。组间比较显示：IP组双TCR T细胞比例（15.32%）>UP组（7.89%），而脾脏中US组（12.88%）与IS组（12.42%）无差异；IP组（15.32%）>IS组（12.42%）。双BCR B细胞方面，UP组（16.02%）>IP组（13.03%），脾脏中两组无差异；IS组（15.88%）>IP组（13.03%）。
4.2 CDR3库的克隆性
克隆扩增（克隆型≥2）比例比较显示：外周血中IP组单TCR（3.84%）>IP组双TCR（3.47%）>UP组单TCR（0.62%）>UP组双TCR（0%）；脾脏中US组单TCR（22.93%）>IS组单TCR（16.97%）>US组双TCR（11.01%）>IS组双TCR（7.46%）。BCR方面，IP组单BCR（10.53%）>UP组单BCR（5.11%）>IP组双BCR（4.95%）>UP组双BCR（0%）；脾脏中IS组单BCR（6.70%）>US组单BCR（5.70%）>IS组双BCR（1.75%）>US组双BCR（1.16%）。
4.3 CDR3库的V基因使用
在IP组中，双TCR T细胞偏好使用TRAV3和TRBV17，而单TCR T细胞偏好使用TRAV5和TRBV2；双BCR B细胞偏好使用IGHV8，单BCR B细胞偏好使用IGHV1。在IS组中，双TCR T细胞偏好使用TRAV1和TRBV10，单TCR T细胞偏好使用TRAV11。与UP组相比，IP组双TCR T细胞偏好使用TRBV19；与US组相比，IS组双TCR T细胞偏好使用TRBV12，双BCR B细胞偏好使用IGHV8和IGHV14。
4.4 EG感染小鼠外周血中的双TCR T和双BCR B细胞
通过scRNA-seq聚类，EG感染小鼠外周血T细胞亚群包括效应CD8T、IFN CD4T、初始CD4T、初始CD8T、Th1、Th2和Treg。双TCR T细胞存在于每个亚群中，分布为：初始CD4T（72.77%）>初始CD8T（12.90%）>Treg（5.29%）>IFN CD4T（4.77%）>效应CD8T（3.10%）>Th2（0.90%）>Th1（0.26%）。克隆扩增方面，双TCR T细胞仅在效应CD8T、初始CD4T和初始CD8T中发生克隆扩增，其中效应CD8T水平最高。B细胞亚群包括Breg、浆细胞、初始B和记忆B。双BCR B细胞存在于每个亚群中，分布为：初始B（57.73%）>浆细胞（17.11%）>记忆B（14.85%）>Breg（10.31%）。双BCR B细胞仅在初始B和记忆B中发生克隆扩增。mRNA表达分析显示，部分亚群中双受体细胞特征基因表达更高，如双TCR Th2细胞表达更高IL-4，双TCR IFN CD4T细胞表达更高Isg15、Isg20和Ifit3，双BCR Breg细胞表达更高Cd1d1。
4.5 EG感染小鼠脾脏中的双TCR T和双BCR B细胞
脾脏中T细胞亚群包括效应CD8T、IFN CD4T、初始CD4T、初始CD8T和Th2。双TCR T细胞存在于每个亚群中，分布为：初始CD4T（36.99%）>Treg（21.92%）>初始CD8T（17.35%）>IFN CD4T（12.79%）>效应CD8T（6.85%）>Th2（4.11%）。克隆扩增方面，双TCR T细胞仅在效应CD8T、IFN CD4T和Treg中发生，效应CD8T水平最高。B细胞亚群包括Breg、浆细胞、初始B、记忆B和分裂B。双BCR B细胞存在于每个亚群中，分布为：初始B（73.44%）>Breg（13.74%）>分裂B（8.26%）>浆细胞（3.99%）>记忆B（0.56%）。发生克隆扩增的双BCR B细胞主要为分裂B细胞。双TCR Treg细胞表达更高Foxp3。
4.6 单/双受体细胞间top 10 mRNA和共享CDR3比较及KEGG分析
EG感染小鼠中，各单TCR T与双TCR T亚群之间、各单BCR B与双BCR B亚群之间的top 10 mRNA表达谱总体一致。未感染小鼠中一致性较低。EG感染小鼠中，单TCR T亚群之间、双TCR T亚群之间以及单双TCR T亚群之间均存在部分CDR3序列共享，BCR方面同样如此，且共享CDR3数量高于未感染小鼠。KEGG富集分析显示，外周血中单BCR B和双BCR B细胞均显著富集“Th1和Th2分化”和“抗原加工与呈递”相关基因集；脾脏中二者均显著富集“肠道IgA产生免疫网络”和“抗原加工与呈递”相关基因集。
五、讨论与结论
本研究的讨论部分指出：EG感染小鼠外周血中双TCR T细胞比例高于未感染小鼠，而脾脏中两组相似，提示外周血双TCR T细胞与EG感染更密切相关。克隆扩增分析显示，EG感染小鼠外周血中双TCR T细胞和双BCR B细胞的克隆扩增均高于未感染小鼠，提示双受体淋巴细胞可能参与针对EG感染的免疫应答或调控。脾脏中EG感染小鼠双TCR Treg细胞表达PDCD1、Lag3和CTLA4等抑制性因子显著高于未感染小鼠，提示发挥抑制作用的双TCR Treg细胞可能与EG感染密切相关。V基因使用偏倚分析提示双受体淋巴细胞可能参与针对EG不同抗原表位的免疫应答，且脾脏与外周血中双TCR T细胞的抗原识别序列可能存在组织特异性。亚群分布分析显示，双TCR效应CD8 T细胞与EG感染密切相关；脾脏中双TCR Treg细胞较单TCR Treg细胞表达更高Foxp3和Ikzf2等抑制性基因，可能发挥更强的免疫调控作用。双BCR记忆B细胞和双BCR分裂B细胞的高克隆扩增提示其密切参与针对EG感染的体液免疫应答。双BCR Breg细胞在外周血中表达更高Cd1d1，可能通过CD1d呈递脂质诱导iNKT细胞分化为具有抗炎功能的新型亚群。单受体与双受体细胞间高度CDR3重叠及一致的mRNA表达谱提示二者针对相同抗原表位并发挥相似的免疫效应功能，但某些细胞因子和转录因子表达的差异提示二者在免疫应答和调控强度上可能存在差异。
研究结论为：通过对EG感染和未感染小鼠脾脏及外周血共享scRNA+TCR+BCR-seq数据的详细比较分析，研究人员首次报道EG感染小鼠中双TCR T细胞和双BCR B细胞可能与针对EG感染的特异性免疫应答和调控相关，特别是克隆扩增的双TCR Treg、双TCR效应CD8 T、双BCR Breg和双BCR记忆/分裂B细胞。这些发现为理解寄生虫感染后复杂的T和B细胞应答提供了新的研究方向。但需强调的是，本研究仅为mRNA水平比较，所观察到的双TCR T细胞和双BCR B细胞的比例和特征需在蛋白表达水平进一步验证，未来可利用荧光基因报告小鼠建立EG寄生虫感染模型，深入研究双受体淋巴细胞潜在的特异性免疫应答机制和效应功能。
