《Crop Science》：A mapping review to identify breeder-friendly quantitative trait loci/gene clusters for wheat biofortification
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摘要：遗传生物强化小麦籽粒以提高铁（Fe）和锌（Zn）含量，是减少人类膳食矿质元素缺乏的一种成本效益高的方法。针对提高Fe和Zn的育种而言，若能鉴定出影响这些性状的高置信度数量性状位点（quantitative trait loci，QTLs）或基因，标记辅助
摘要：遗传生物强化小麦籽粒以提高铁（Fe）和锌（Zn）含量，是减少人类膳食矿质元素缺乏的一种成本效益高的方法。针对提高Fe和Zn的育种而言，若能鉴定出影响这些性状的高置信度数量性状位点（quantitative trait loci，QTLs）或基因，标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS）将从中受益。研究人员针对与小麦籽粒/植株Fe和/或Zn矿质含量相关的位点开展了映射综述，并在51篇出版物中识别了QTL作图研究、全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）以及影响Fe和Zn吸收与转运的已表征基因转录组研究结果之间的一致性。所提取信息被叠加到基于小麦90K Illumina单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片的连锁图谱与物理位置一致性图谱上。研究人员使用了一种称为Interval-MAST（markers around segregating traits）的新型图形方法，该方法可比常用Meta分析算法纳入更大体量的信息。研究人员鉴定了22个与籽粒Fe和/或Zn浓度增加相关的标记簇，其中7A和7B染色体含有最高密度的簇。研究结果进一步支持了先前报道的位于2B染色体上的meta-QTL（MQTL）的重要性，其相关标记为“barc159”。其余21个标记簇可能是通过本映射研究凸显的新的关键基因组区域。最后，对在这些标记簇内检索到的候选基因进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析，揭示了GO术语GO:0010043，其与响应锌的生物过程相关，作为一组直接与生物强化相关的基因。
通俗语言摘要：如果研究人员能更好地洞察影响性状最大的基因组区域，小麦营养特性遗传改良周期可以缩短。本研究目标是通过图形化汇总51项遗传作图和基因表达研究的结果，为影响小麦籽粒Fe和Zn浓度的基因组区域知识库作出贡献。本研究中强调的所有标记簇均提示同时改良这两个性状的可能性。7A和7B染色体上重要基因组区域的丰富性表明，可开发分子标记以选择籽粒中更高的Fe和Zn浓度并对因果位点进行精细定位。本研究鉴定出8个基因和1个meta-QTL（MQTL）作为标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS）策略开发的良好候选。本研究的图形化方法能够检测到先前Meta分析未报道的高置信度基因组区域。
1 INTRODUCTION
该研究围绕隐性饥饿和矿质元素缺乏展开，指出传统补充和食品强化在低收入社区受成本限制，而通过植物育种提高主粮作物必需矿质元素含量的遗传生物强化更具适用性。籽粒矿质含量属于数量性状，传统育种选择困难，早期世代材料又难以进行矿质测定，因此若能发现可靠的数量性状位点（quantitative trait loci，QTL）或基因，标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS）将有助于提高育种效率。QTL分析、全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）和转录组研究均可提供候选位点或基因，但单一研究存在标记平台不同、群体等位基因不同、假阳性、统计功效有限和环境变异等问题。已有meta-QTL（MQTL）和meta-GWAS方法虽可整合数据，但分别局限于双亲QTL研究或GWAS研究，且往往难以纳入转录组数据和格式不兼容的结果。因此，本研究采用映射综述策略，广泛整合涉及小麦籽粒Fe和Zn含量的MQTL、双亲QTL、GWAS和转录组研究，将位点投射到遗传和物理图谱上，以识别可用于验证和选择的候选热点。
Core Ideas
该部分提出：MAS可提高谷物籽粒生物强化育种效率；在独立作图研究中被重复鉴定的位点可作为MAS的良好候选；图形化比较作图可补充传统meta-QTL分析，并利用更广泛的基因组信息；本研究纳入的一个meta-QTL因与已表征的Fe/Zn基因共定位而得到进一步支持。
2 MATERIALS AND METHODS
2.1 Database search
研究人员于2022年7月20日检索Agricola、PubMed和CAB direct三个数据库，使用与小麦及近缘种相关的检索式，目标为报道控制籽粒Zn和Fe含量的位点、QTL和已表征Fe/Zn基因的研究。纳入文献类型包括meta分析、系统综述、GWAS、双亲作图研究和功能研究。对于影响Fe/Zn积累的基因研究，因Agricola检索结果过多而排除。研究人员还从文献中发现并检索了QTLdb数据仓库，并在2024年10月19日以相同检索式更新相关出版物列表。
2.2 Data extraction
研究人员记录出版物的数字对象标识符（Digital Object Identifier，DOI）。对每项研究中的每个QTL，记录QTL名称、侧翼标记或位置标记名称、染色体编号、标记起始碱基对位置、相关性状名称、加性效应、对数优势比（logarithm of the odds，LOD）得分和R
2。若QTL未报告碱基对位置或序列信息，则通过GrainGenes、Gramene、CerealsDB或DArt标记库检索标记名称或基因名称。对于仅提供引物序列的QTL，使用Primer-BLAST和NCBI检索序列位置；标记序列的物理位置通过BLAST比对到国际小麦基因组测序联盟（International Wheat Genome Sequencing Consortium，IWGSC）中国春小麦基因组2.1版本获得。
2.3 Data filtering
无法检索序列信息的标记/基因被排除。每个标记采用最显著的BLAST结果确定基因组位置，并要求该位置与原研究报道的染色体一致。若Primer-BLAST查询序列与中国春基因组序列错配超过2个核苷酸，则排除该标记。若标记比对到与原研究不同的染色体，也予排除。若标记区间左右任一侧标记缺失，则丢弃该区间。当引物序列过长超出Primer-BLAST处理范围时，直接使用核苷酸BLAST检索，并仅采用定位到作图染色体唯一位置的引物。
2.4 Bioinformatics
由于不同研究报告方式不同、缺乏共识标记且连锁图谱不兼容，直接进行位置比较困难，因此需要物理参考图谱。标记-性状关联检测依赖于标记与因果等位基因之间的重组率，而小麦不同物理区域重组率和连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）差异明显。比较作图部分基于先前利用90K Illumina单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片构建的共识连锁图。研究人员用名为Interval-MAST（markers around segregating traits）的脚本整合IWGSCv2.1物理距离与遗传位置。若至少3个来自独立研究的QTL或候选基因标记位于同一碱基对位置，或位于5 Mb距离内，且至少1个与Fe/Zn积累相关的QTL或基因标记与先前报道的MQTL位于同一区间或5 Mb内，则该热点被视为更有意义。5 Mb区间依据小麦LD衰减慢和自花授粉特性设定。纳入的51项研究中，2项为MQTL分析，42项为未用于先前meta分析的原创研究，7项为已纳入先前meta分析的原创研究。结果以Interval-MAST染色体图、表型图、R 4.4.1柱状图和CMplot标记密度图展示，并投射Gpc-B1以观察其是否聚集于感兴趣区域。
2.5 Candidate genes and orthologues
研究人员提取标记区间内所有基因，并分别针对Fe、Zn以及Fe和Zn性状进行基因本体论（gene ontology，GO）富集分析，使用TBtools默认参数，以p<0.05判断生物学显著性。随后进一步过滤GO富集结果，关注与目标性状最相关的基因功能，并在UniProt或InterPro中检索所选基因的分子功能。
3 RESULTS
3.1 Collection of the mapping data
经过数据过滤后，本研究纳入的位点数量多于以往仅关注小麦矿质营养性状的MQTL分析。共有来自51项相关研究的870个位点用于作图，其中629个为QTL，241个为与已表征Fe/Zn积累基因相关的标记。数据来自37项QTL研究和14项关于小麦及其近缘种Fe/Zn积累基因表征的研究。两项先前MQTL研究和7项曾用于先前MQTL分析的独立QTL作图研究也被纳入。部分报道的QTL无法映射，原因包括标记未比对到原研究报道的正确染色体，或无法获得完整核苷酸序列；2020年前QTL作图研究中使用的单序列重复（single sequence repeats，SSR）标记尤其难以处理，因为引物序列BLAST到参考基因组后难以获得高置信相似区域。
3.2 Genome coverage of QTLs and genes associated with Fe and Zn concentration
QTL在基因组中的分布显示，D基因组包含的已映射QTL和基因最少，这与六倍体小麦形成过程中遗传瓶颈有关。A和B基因组具有相似的多态性水平，对应数量相近的Zn和Fe籽粒含量QTL和基因；B基因组QTL数略高，为283个，而A基因组为250个。这些观察与小麦基因组遗传多样性的已有模式一致。整理后的QTL分布于小麦所有染色体，符合Zn和Fe性状的数量遗传特征。标记在全基因组近似随机分布，其中2A染色体标记数最高，为82个，5D染色体最低，为17个。由于端粒区重组率高，映射到端粒区的标记多于着丝粒区。
3.3 Candidate marker clusters for Fe and zinc accumulation in wheat
研究人员利用标记物理位置和厘摩位置检查共定位并识别控制Zn和Fe籽粒含量的热点。Interval-MAST图分为三部分，分别展示标记位置、QTL或MQTL区间以及LOD得分，并用颜色区分Zn、Fe及二者兼有的标记。根据设定标准，共鉴定出22个标记簇或热点，分布于几乎所有染色体，但1D、3D、4A、4B、5B、6A和7D除外，这些簇值得进一步研究。7B染色体拥有最多标记簇。先前报道的2B染色体MQTL（barc159）的有效性得到进一步支持，因为它与IWB26954和TaVTL5共定位，而这两个标记未纳入该meta分析所用研究。其余标记簇可能是通过本映射研究凸显的新关键基因组区域。22个标记簇中只有5个没有已表征Fe/Zn基因映射于区间内，说明多数簇含候选基因。重点关注的已表征Fe/Zn基因家族包括TaZIP、TaVIT、TaMAPK、TaNAS和TaHRZ；TaFer和TaNAAT虽未映射到上述簇中，也被认为在矿质稳态中具有重要功能。Gpc-B1映射到6B染色体一个标记簇附近，提示其在不同遗传背景中可能仍有用。
3.4 Candidate genes and orthologous genes
在所有标记区间内共检索到约1500个候选基因。GO富集分析显示多个术语在分子功能、生物过程和细胞组分三类中显著关联。与目标性状相关的一个重要GO术语为GO:0010043，属于“ response to zinc ”生物过程类别。该基因家族中的候选基因TraesCS2B03G0526600位于2B染色体，与已报道的籽粒Zn相关标记Ku_c6546_718完全匹配；同一研究报道有利等位基因T可使籽粒Zn浓度增加+3.21 mg kg
?1，来源于T. kiharae（AtAtGGDD）和T. dicoccum（AABB）。TraesCS6D03G0882600位于6D染色体QTL簇内。相关候选基因的分子功能包括Zn/金属离子结合、ATP结合、金属离子转运、DNA结合转录因子、P型Zn
2+转运蛋白和Zn转运蛋白等。
4 DISCUSSION
本研究目标是识别与小麦籽粒较高Fe和Zn含量相关的基因组热点。为克服常规MQTL和meta-GWAS分析的限制，研究人员开展广泛文献检索，整合MQTL、QTL、标记-性状关联和基因表达研究。通过BLAST将不同标记平台的位点锚定到基因组图谱，使多样标记平台之间可比较；高质量共识连锁图和物理参考基因组为连锁分析提供框架。图形化汇总有助于检测最适合MAS改良籽粒Fe和Zn积累的基因组区域，许多区域还因包含至少一个已表征Fe/Zn基因而增强可信度。Fe和Zn籽粒浓度位点共定位，提示可能通过加性和协同标记效应同时改良两个性状。已有观点认为，通过MAS选择性状位点单倍型比选择单个QTL更适合转移重要QTL组合。结果还显示，多数多态性QTL位于着丝粒区域外。尽管标记覆盖较广，B亚基因组包含更多Fe和Zn积累相关QTL和基因；类似趋势在其他分析和其他六倍体小麦性状中也曾出现。B亚基因组着丝粒周围区域也比着丝粒区域更易发生遗传变异。B亚基因组DNA量较大且多态性较高，而D亚基因组发现频率低可能部分源于参考研究中多态性标记频率较低，并不一定代表缺乏农艺相关基因变异。最突出的热点位于7A和7B染色体。7A染色体614–615 Mb区域被5项独立研究认为对Zn和Fe积累重要，该区域还曾与产量、干旱、热胁迫以及可能与镉相关，因此导入时需特别考虑连锁累赘。7B染色体490–745 Mb区域包含4个与Fe和Zn相关的标记簇，对生物强化有前景。该映射方法还可通过将投射的MQTL与更直接观察交叉参照来验证MQTL。2B染色体先前MQTL（barc159）因与独立标记-性状关联IWB26954共定位而得到GWAS验证。多个重要Fe和Zn积累基因家族与本研究观察到的簇共定位。22个簇中有17个包含至少一个来自表达研究的基因家族成员。最突出的基因家族为TaZIP，并存在于7A和7B所有簇中；TaZIP家族成员与Zn和Fe从根向地上部转运以及Zn稳态相关，可提高植物对高金属浓度的耐受性。TaZIP14-B位于3B染色体，曾与欧洲小麦品种Paragon和生物强化品种Zincol-16中较高Zn含量相关。其他具生物强化潜力的基因家族包括调节肌醇磷酸的肌醇磷酸激酶，其中TaIPK1-2可提高籽粒Fe、Zn浓度和千粒重；TaNAS、TaNAAT和TaDMAS参与金属螯合分子合成与调控，影响植物离子吸收。TaIPK1-2D和TaNAS10-6D分别与2D和6D染色体上两个主效QTL紧密连锁，TaNAS10-6D可使籽粒Zn浓度增加3.9%–6.6%。与Zincol-16比较时，除TaMAPK和TaHRZ外，所有报道的Fe/Zn基因家族在发育种子中过表达，且TaDMAS在Zincol-16中高表达。定位因果基因并开发基于基因的标记可加快生物强化育种周期。小麦中唯一利用完美标记进行营养含量MAS的例子是6B染色体上的Gpc-B1；较高Zn浓度与较高蛋白含量相关，因为Gpc-B1诱导叶片早衰并促进矿质向发育种子转移。本研究鉴定出8个具有较强生物强化和MAS潜力的候选基因。这些基因在大麦、水稻和玉米中的类似功能增强了其在 wheat 中预测功能的可信度。值得注意的是，所有候选基因在7B染色体标记簇TdZIP7B-3–TaMPK4内共定位，使该簇成为尝试MAS的特别强基因组区域。未来需要通过精细定位、构建更多双亲群体、近等基因系（near isogenic lines，NILs）以及CRISPR/Cas9和转基因等遗传工程方法验证8个候选基因和已识别标记簇的效应。
5 CONCLUSIONS
生物强化正成为许多育种计划的重要研究组成部分。本研究旨在发现与小麦Fe或Zn积累具有一致报道关联的基因组区域。对QTL、标记-性状关联和已表征Fe/Zn积累基因的文献汇总显示，21条染色体中有10条包含强烈值得进一步研究的位点。在21个良好候选基因组区域中，1个位于先前MQTL附近，其余可能是本研究凸显的新基因组区域。标记Xbarc121可用于评估微量营养素和产量双重改良的潜力。本研究提供了一种利用Interval-MAST脚本，以物理位置图形化评估标记之间真实接近程度的有效方法。
