网络毒理学、机器学习、单细胞分析与分子对接揭示6PPD/6PPD-Q相关心房颤动分子特征

《Journal of Advanced Research》：Network toxicology, machine learning, single-cell analysis, and molecular docking reveal 6PPD/6PPD-Q-associated atrial fibrillation signatures

• N-(1,3-dimethylbutyl)-N’-phenyl-p-phenylenediamine（6PPD）及其氧化产物6PPD-quinone（6PPD-Q）被鉴定为心房颤动（atrial fibrillation，AF）的潜在环境风险因素。
• 网络毒理学（network toxicology）和机器学习（machine learning）揭示了6PPD/6PPD-Q的16个AF相关分子靶点。
• DDR1、BCHE、HTR2B和KCNJ3被鉴定为AF中关键暴露相关核心基因（hub genes）。
• 单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing）显示核心基因在心肌细胞和血管细胞中的细胞类型特异性表达。
• 体外（in vitro）和体内（in vivo）验证证实6PPD/6PPD-Q暴露后核心基因呈剂量依赖性上调。

该论文发表在《Journal of Advanced Research》。心房颤动（atrial fibrillation，AF）是全球最常见的持续性心律失常之一，与缺血性卒中、心力衰竭和全因死亡风险显著增加相关，构成重大全球公共卫生负担。随着代谢紊乱和人口老龄化，AF发病率和患病率持续上升，导致医疗资源使用和社会经济成本增加。传统心血管危险因素被认为是AF发病的主要因素，但近期研究将环境暴露与AF发生及较差临床结局联系起来，支持“心脏暴露组学（cardiac exposome）”概念，即外部化学因素通过氧化应激、炎症反应以及电重塑和结构重塑触发致心律失常心房环境。因此，识别相关毒物及其扰动分子通路对理解环境对AF的贡献重要。N-(1,3-dimethylbutyl)-N’-phenyl-p-phenylenediamine（6PPD）是汽车轮胎橡胶抗氧化剂和抗臭氧剂，随轮胎磨损颗粒释放并持续造成环境污染。6PPD-quinone（6PPD-Q）是6PPD在臭氧存在下快速氧化形成的产物。6PPD-Q生态毒性受关注，尤其与银鲑城市径流死亡综合征相关，并对多种水生生物有害。环境监测和人体生物监测证实6PPD和6PPD-Q广泛存在于环境介质及尿液、血液等生物样本。尽管人类暴露已确认，长期环境暴露的健康影响仍不完全清楚。实验研究表明6PPD和6PPD-Q可在多个实验模型包括心血管系统中诱导氧化应激、线粒体功能障碍和组织损伤。然而环境暴露与心血管风险关系尚未完全阐明，慢性暴露是否促进心房重塑和增加AF易感性仍未知。AF发生涉及触发因素和易感心房基质，包括离子通道活动、钙处理、心肌结构以及局部炎症和免疫环境等多层次变化；电重塑、结构重塑、自主神经失衡和慢性炎症均参与心房致心律失常。流行病学研究报道颗粒物暴露和交通相关空气污染与AF风险增加相关。但轮胎衍生污染物6PPD和6PPD-Q研究主要关注生态毒性及代谢或免疫效应，其对心房分子网络和心律失常的相关性定义不清。网络毒理学通过整合多组学数据和构建“化合物-靶点-疾病”相互作用网络，结合蛋白-蛋白相互作用（protein–protein interaction，PPI）和通路富集，可从宏观层面表征多组分、多靶点毒物如何破坏疾病相关分子网络。机器学习可从高维、噪声生物医学数据中提取信息特征，识别关键基因和潜在诊断生物标志物，并通过可解释人工智能量化各特征对模型预测的贡献。因此，研究人员应用整合网络毒理学和机器学习框架，阐明6PPD/6PPD-Q暴露与AF的分子联系。研究人员将AF相关转录组数据和策展基因集与计算机靶点预测结合，识别候选暴露响应基因，并用机器学习模型优先化；关键靶点生物学相关性进一步通过单细胞表达谱、通路富集分析、分子对接及人心脏成纤维细胞体外验证。

技术方法：研究人员整合GEO数据集GSE41177、GSE79768、GSE115574，标准化和批次校正；从GeneCards检索AF基因，行差异表达分析和加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）。从PubChem获取6PPD/6PPD-Q结构，用相似性集成方法（Similarity Ensemble Approach，SEA）、PharmMapper、SwissTargetPrediction预测靶点；构建PPI网络（STRING、Cytoscape），行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集；用11种机器学习算法生成113个模型，五折交叉验证，SHAP解释；分析单细胞RNA测序GSE198204；用AlphaFold和UniProt结构行分子对接，Vina评分；体外用人心脏成纤维细胞暴露6PPD（2.5、5.0 μM）或6PPD-Q（0.25、0.50 μM）24 h，行qRT-PCR和western blot；体内用雄性C57BL/6小鼠（n=50；6–8周龄，20–25 g，来源Hubei Biont Biological Technology Co., Ltd.，Hubei, China），分vehicle control（n=18）、vehicle+Ach/CaCl₂（n=12）、6PPD+Ach/CaCl₂（n=10）、6PPD-Q+Ach/CaCl₂（n=10），Ach/CaCl₂尾静脉注射4周，6PPD（10 mg/kg）或6PPD-Q（4 mg/kg）每三天腹腔注射4周，电生理评估；GraphPad Prism 10.1.2统计。

研究结果：
1. AF相关基因的整合鉴定（Integrated identification of AF-related genes）：整合GSE41177、GSE79768、GSE115574，PCA显示批次校正后AF与对照明显分离；差异表达分析识别249个显著失调基因；WGCNA在β=5时满足无标度拓扑，得到6个模块，多个模块与AF显著相关；整合差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）、WGCNA模块基因和GeneCards高置信基因（相关性评分≥20），得到522个候选AF相关基因。
2. 6PPD/6PPD-Q靶点预测及与AF相关基因重叠（Prediction of 6PPD/6PPD-Q targets and overlap with AF-related genes）：从PubChem获得SMILES和三维结构，用SEA、PharmMapper和SwissTargetPrediction共识预测并去重，得到496个独特潜在靶点；与AF相关基因重叠后识别16个关键候选靶点。
3. 重叠靶点的PPI网络拓扑与功能富集（Protein-protein interaction network topology and functional enrichment of overlapping targets）：构建6PPD/6PPD-Q–靶点–AF调控网络；STRING构建PPI，Cytoscape可视化和计算节点度中心性；GO富集主要与心脏电生理、心脏结构和心肌活动相关；KEGG显示主要参与神经传递和神经营养因子相关信号，也富集在内分泌和肿瘤相关通路。
4. 基于机器学习的AF核心基因识别（Machine learning-based identification of hub genes for AF）：对16个靶点用11种算法生成113个模型，五折交叉验证；大多数模型训练和测试表现一致，无明显过拟合，na?ve Bayes及其与glmBoost和StepGLM的集成组合最佳；SHAP显示DDR1、BCHE、HTR2B和KCNJ3平均绝对SHAP值最高，是模型预测主要驱动因素；DDR1和BCHE影响最大，表达越高预测AF概率越大；ROC曲线评估四个基因个体诊断价值。
5. 人房组织核心基因单细胞表达模式（Single-cell expression patterns of hub genes in human atrial tissue）：GSE198204包括3例窦性心律对照和3例AF患者心房组织；t-SNE聚类识别主要细胞群，用经典标记基因注释；核密度t-SNE显示BCHE、DDR1、HTR2B和KCNJ3非均匀表达，在心肌细胞和平滑肌/成纤维细胞相关簇中形成高密度热点，淋巴和髓系细胞群信号稀疏或缺失。
6. GSEA揭示核心AF靶点功能特征（Functional signatures of hub AF targets revealed by GSEA）：按DDR1、BCHE、HTR2B、KCNJ3中位表达分高/低组行KEGG GSEA。DDR1高表达组富集心肌重塑相关通路，低表达组富集IgA肠道免疫网络、利什曼感染、帕金森病、核糖体、RNA降解；BCHE高表达组富集神经退行性和蛋白周转，低表达组富集血液恶性肿瘤、适应性免疫和代谢控制；HTR2B高表达组富集免疫激活和自身免疫，低表达组富集心肌收缩和细胞能量代谢；KCNJ3高表达组富集神经退行性和细胞能量代谢，低表达组富集细胞黏附分子、趋化因子信号、造血细胞谱系、利什曼感染和原发性免疫缺陷。
7. 核心靶点分子对接（Molecular docking of hub targets）：对DDR1、BCHE、HTR2B和KCNJ3，用AlphaFold和UniProt蛋白结构行分子对接，Vina评分评估。6PPD和6PPD-Q均与四个蛋白显示良好预测结合，Vina评分约?8.7至?7.5 kcal/mol，提示有利结构兼容性。
8. 6PPD/6PPD-Q相关候选靶点的体外和体内验证（In vitro and in vivo validation of 6PPD/6PPD-Q-associated candidate targets）：体外western blot显示6PPD或6PPD-Q暴露后DDR1、BCHE、HTR2B、KCNJ3条带强度高于DMSO对照，提示蛋白丰度增加；qRT-PCR显示mRNA显著增加（P<0.05）。体内小鼠暴露6PPD或6PPD-Q并Ach/CaCl₂处理4周建立AF易感模型；与vehicle+Ach/CaCl₂组比，两种暴露均显著增加AF诱发率，两组间无显著差异；延长可诱发AF持续时间；心脏组织Ddr1、Bche、Htr2b、Kcnj3 mRNA显著增加。

讨论部分总结：研究人员采用整合网络毒理学和机器学习框架研究6PPD和6PPD-Q如何促进AF。整合三个独立AF转录组数据集和GeneCards相关基因，识别16个候选基因；机器学习优先DDR1、BCHE、HTR2B和KCNJ3为连接暴露与AF易感性的潜在分子联系。DDR1是胶原激活受体酪氨酸激酶，涉及细胞外基质信号、心脏纤维化和心房/心室结构重塑；BCHE编码丁酰胆碱酯酶，参与胆碱能信号和酯代谢，可能通过自主和胆碱能调节影响心房电生理；HTR2B是血清素受体，与瓣膜性心脏病、心脏肥大、成纤维细胞激活和心肌炎症反应相关；KCNJ3编码G蛋白激活内向整流钾通道GIRK1亚基，参与Ach激活钾电流，参与心房动作电位调节和AF易感性。四个基因可能在AF病理生理中起互补作用，但诊断相关性需前瞻性临床验证。单细胞RNA测序显示四个基因在心肌细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞簇中相对富集，淋巴和髓系较低；KEGG GSEA提示高/低表达与心肌病和心脏重塑、神经退行性和蛋白周转、线粒体能量代谢、免疫炎症反应等通路模块相关。分子对接提示6PPD或6PPD-Q与四个蛋白产物有良好结构兼容性；人心脏成纤维细胞暴露后mRNA和蛋白增加。研究指出，分子对接提供计算机评估，表达实验显示暴露相关分子反应，但不能证明预测的化合物-蛋白相互作用直接导致mRNA或蛋白变化。在AF易感小鼠模型，6PPD或6PPD-Q增加AF诱发率，心脏组织候选靶点表达增加，支持暴露与候选靶点表达改变及AF易感性增加相关。但化合物-蛋白相互作用、靶点调控和AF发展之间机制联系仍需建立。6PPD在环境条件下可快速氧化为6PPD-Q，但体内转化程度不清；6PPD-Q可能因化学性质和生物相互作用差异而具有独特生物活性。本研究中两种化合物均增加AF诱发率并诱导相似表达模式，6PPD-Q在较低剂量下产生与6PPD相当的效果，但研究未专门区分化合物特异性机制。暴露剂量根据既往体内毒理学研究选择；6PPD-Q毒代动力学显示迅速分布多组织并通过代谢转化和排泄消除，组织消除半衰期数小时至一天；体外显示CYP介导氧化代谢；但这些数据不能确定心脏分子或电生理效应持续时间，且来自单次口服暴露，不能直接外推重复腹腔方案。人体生物监测显示尿液6PPD和6PPD-Q浓度，但不能直接转换为给药剂量或靶组织浓度，因此本研究暴露方案主要用于机制研究和危害识别，而非重现当前人类环境暴露水平。局限性包括：转录组数据回顾性且样本量有限；批次校正后残余异质性；bulk组织稀释细胞类型特异性变化，一些核心基因在心房组织水平仅适度倍数变化，但通过WGCNA、GeneCards相关性、网络拓扑、机器学习和单细胞图反复选择减轻；体外使用人心脏成纤维细胞系不能完全重现人心房肌细胞或窦房结细胞表型，对接和表达变化未证明致心律失常效应；不能确定预测的化合物-蛋白相互作用是否在活细胞中发生或因果贡献；信号和转录机制未解决；体内实验显示AF诱发率增加和关键基因上调，但电生理机制未全面表征，小鼠模型可能不完全模拟人AF复杂性；未直接测量循环或心脏6PPD、6PPD-Q或转化产物浓度；毒代动力学参数来自单次口服暴露，不能直接外推重复腹腔方案；AF诱发率仅在暴露结束时评估，不能确定增加易感性的持续性；未来需要药代动力学剖面和纵向电生理评估；直接靶点参与试验、基因沉默或过表达实验、人房心肌细胞或心脏类器官模型。

结论翻译：研究人员的发现提示，轮胎衍生化学物质6PPD和6PPD-Q可能通过多靶点网络破坏心脏电生理、结构重塑和免疫-代谢信号传导，从而促进AF发展。通过整合网络毒理学、机器学习、单细胞分析、分子对接以及体外和体内验证，研究人员的发现为将环境暴露与心律失常风险关联提供机制基础，并为未来AF预防和临床干预研究提供框架。