Ccombody作为免疫预防策略对凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）抗急性肝胰腺坏死病（AHPND）免疫基因表达的影响

《Journal of Fish Diseases》：Efficacy of Ccombody as an Immunoprophylaxis Strategy: Impact on Immune Gene Expression of Pacific White Shrimp (Penaeus vannamei) Against Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND)

急性肝胰腺坏死病（AHPND）由携带质粒的副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VpAHPND）菌株引起，该菌株产生PirA和PirB毒素，特异性靶向并损伤对虾肝胰腺及胃肠道上皮细胞。AHPND的影响以及对抗生素耐药性的担忧，促使研究人员探索替代性疫病预防策略。本研究评估了Ccombody（一种靶向PirA毒素的重组可变淋巴细胞受体B（VLRB）抗体）对感染VpAHPND的凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）免疫相关基因表达及存活率的影响。研究人员将实验对虾分为六个实验组，每组设三个重复。两个对照组饲喂基础商品饲料：未攻毒阴性对照组和VpAHPND攻毒阳性对照组。另设一个参考组，饲喂添加IgY（500 mg/100 g饲料）的商品饲料。其余三个处理组分别饲喂添加Ccombody（1、10或100 mg/100 g饲料）的饲料，持续7天。在饲喂后第7天（7 d.p.f.），各处理组间酚氧化酶原-2（proPO-2）、抗脂多糖因子-1（ALF-1）和对虾素-4（PEN4）的表达水平无显著差异。在感染后24小时（24 h.p.i.），Ccombody各组的proPO-2表达与阳性对照组和阴性对照组均存在显著差异（p < 0.05），而Ccombody处理组之间无显著差异。ALF-1表达在各处理组间保持不变。相比之下，Ccombody 1和10 mg/100 g饲料组的PEN4表达较阳性对照组显著增强（p < 0.05）。值得注意的是，Ccombody 1 mg/100 g饲料组在24 h.p.i.时PEN4表达较7 d.p.f.显著升高（p < 0.05），而阳性对照组和Ig-Guard A组则观察到表达下降。主成分分析（PCA）在7 d.p.f.和24 h.p.i.两个时间点的基因表达分析中也显示出相同的散点分布趋势。饲料中添加Ccombody（1、10和100 mg/100 g饲料）可有效降低AHPND致病性副溶血性弧菌攻毒后的死亡率。所有添加组与阳性对照组相比，死亡率均呈极显著降低（p < 0.001）。其中，10和100 mg/100 g饲料组的死亡率最低（分别为3.70% ± 1.28%和3.70% ± 3.39%）。结合免疫相关基因表达的综合分析，这些发现表明Ccombody作为预防VpAHPND的替代性免疫预防策略具有巨大潜力。

论文解读：Ccombody对凡纳滨对虾抗急性肝胰腺坏死病的免疫预防作用

一、研究背景与科学问题

急性肝胰腺坏死病（AHPND）是由携带特定质粒的副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp_AHPND）引起的对虾烈性传染病，该病原通过产生PirA和PirB毒素，特异性损伤对虾肝胰腺及胃肠道上皮细胞，导致消化系统功能障碍，严重时可造成高达100%的死亡率。自2009年在中国首次报道以来，AHPND已迅速蔓延至越南、马来西亚、泰国、墨西哥、菲律宾和南美洲等多个国家和地区，受影响地区的对虾产量骤降至正常水平的约60%，仅在亚洲（中国、马来西亚、泰国和越南）和墨西哥造成的经济损失估计高达430亿美元。凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）作为全球水产养殖业的重要经济物种，仅具备先天免疫系统，缺乏适应性免疫，主要依赖酚氧化酶原（proPO）激活系统、活性氧系统和抗菌肽（AMP）系统等体液免疫组分抵御病原入侵。传统防控手段面临抗生素耐药性日益严重、治疗选择有限等严峻挑战，因此亟需开发新型、安全、有效的替代性免疫预防策略。重组抗体技术因其高病原特异性而备受关注，其中卵黄免疫球蛋白Y（IgY）已被应用于白斑综合征病毒（WSSV）的防控，但IgY生产成本高昂、耗时费力且铰链区结构灵活性受限。基于这些局限性，源自盲鳗等无颌脊椎动物的重组可变淋巴细胞受体B（VLRB）抗体——即Ccombody，作为新兴的水产动物治疗策略受到关注。VLRB由富含亮氨酸重复模块构成，形成马蹄形多聚体结构，能够高亲和力、高特异性地结合抗原。前期研究已证实靶向PirA毒素的VLRB能够中和该毒素并在Vp_AHPND攻毒模型中提高对虾存活率，但其对先天免疫激活、基因表达及攻毒后免疫动态的广泛免疫调节作用仍不清楚。本研究旨在系统评估饲料添加Ccombody对凡纳滨对虾免疫相关基因表达及Vp_AHPND攻毒后存活率的影响，验证Ccombody可能作为对虾先天免疫系统刺激剂的假说。

二、主要技术方法

研究人员从泰国符合良好水产养殖规范（GAP）认证且经特定病原体检测确认无WSSV、桃拉综合征（TSV）、黄头病毒（YHV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）、传染性肌坏死病毒（IMNV）和AHPND的养殖场获取凡纳滨对虾（PL20期幼虾）。实验设计包含两个平行试验：存活攻毒试验和免疫基因表达分析，共设六个处理组（每组三个重复）：阴性对照组、阳性对照组、Ig-Guard A（500 mg/100 g饲料）参考组以及Ccombody 1、10和100 mg/100 g饲料三个处理组。对虾饲喂相应试验饲料7天后，采用三种Vp_AHPND菌株（VPNJ293、VPNJ361和VPNJ463）混合液进行浸泡攻毒（最终浓度5.53 × 10⁷ CFU/mL），攻毒24小时后换水并连续监测7天存活率。在7 d.p.f.和24 h.p.i.两个时间点采集肝胰腺组织样本（每组6只），提取总RNA并逆转录合成cDNA，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测proPO-2、ALF-1和PEN4三个免疫相关基因的表达水平，以β-actin为内参基因，采用2^?ΔΔCT法进行相对定量。存活数据采用Kaplan-Meier生存分析和Log Rank检验，基因表达数据经log₂转换后采用双因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验，同一处理组内不同时间点的比较采用配对t检验，并利用主成分分析（PCA）对基因表达数据进行多变量分析。

三、研究结果

3.1 饲料添加Ccombody对所选免疫基因表达的影响

在7 d.p.f.时，各处理组间proPO-2、ALF-1和PEN4的基础表达水平均无显著差异（p > 0.05），表明Ccombody或Ig-Guard A的预防性添加在无病原存在的情况下不会组成性上调或下调这些特定免疫转录本。

3.2 攻毒后24小时炎症相关免疫基因表达

在24 h.p.i.时，阳性对照组与阴性对照组的proPO-2表达存在显著差异（p < 0.05），而Ccombody各剂量组和Ig-Guard A组与其他处理组间无显著差异。多数处理组感染后proPO-2表达呈下降趋势，但Ccombody 1和100 mg/100 g饲料组感染后较7 d.p.f.呈上升趋势。ALF-1表达在各处理组间始终无统计学差异，但Ig-Guard A组在24 h.p.i.时ALF-1表达较7 d.p.f.显著升高（p < 0.05）。PEN4表达方面，Ccombody 1和10 mg/100 g饲料组在24 h.p.i.时显著高于阳性对照组（p < 0.05），而阳性对照组和Ig-Guard A组PEN4表达下降。组内比较显示，Ccombody 1 mg/100 g饲料组在24 h.p.i.时PEN4表达较7 d.p.f.显著升高（p < 0.05）。

3.3 主成分分析（PCA）

PCA分析显示，7 d.p.f.对虾无论接受何种饲料处理均紧密聚集，未观察到Ccombody或Ig-Guard A添加引起的任何一致方向性变化，表明这些产品不会组成性激活免疫系统。而24 h.p.i.对虾表现出显著更大的离散度，显示攻毒后转录变异性增强。其中Ccombody 100 mg/100 g饲料组对虾偏离中心簇最为明显，多个个体表现出ALF-1和proPO-2表达升高，而阳性对照组对虾则紧密聚集且与补充组明显分离。

3.4 攻毒后死亡率

阳性对照组在感染后第一天累积死亡率即达15.56%，48 h.p.i.时达到峰值74.81%。相比之下，Ccombody各剂量组和Ig-Guard A组第一天死亡率仅为1.48%至2.96%。实验结束时（168 h.p.i.），阳性对照组死亡率最高（74.81% ± 6.79%），阴性对照组最低（0.74% ± 1.28%）。Ig-Guard A组死亡率为12.60% ± 5.13%，Ccombody 1、10和100 mg/100 g饲料组分别为8.15% ± 3.39%、3.70% ± 1.28%和3.70% ± 3.39%。所有Ccombody添加组与阳性对照组相比死亡率均极显著降低（p < 0.001）。

四、讨论与结论

研究结果表明，Ccombody的预防性给药不会在感染前触发proPO-2、ALF-1或PEN4等免疫基因的组成性激活，这对水产养殖治疗剂而言是极为有利的特性，因为慢性先天免疫刺激可导致对虾代谢耗竭、组织损伤和生长减缓。攻毒后，阳性对照组proPO-2和PEN4表达显著低于阴性对照组，提示未经处理的Vp_AHPND攻毒对虾在24 h.p.i.时可能表现出免疫受损状态，而Ccombody各剂量组和Ig-Guard A组总体表达水平高于阳性对照组，表明能够缓解Vp_AHPND诱导的免疫抑制。不同剂量下proPO-2表达的不一致性提示Ccombody可能不呈现明确的剂量依赖性效应。ALF-1在Ccombody 100 mg/100 g饲料组和Ig-Guard A组中表达升高，提示较高剂量可能增强ALF-1应答能力。PEN4表达在Ccombody处理下呈负剂量依赖性趋势，低剂量组变异更大而高剂量组表达更稳定。综合来看，Ccombody和Ig-Guard A补充均可防止Vp_AHPND攻毒后PEN4表达的显著下调。足够剂量的Ccombody和IgY可能能够中和PirA毒素，减少毒素介导的肝胰腺损伤，使针对革兰氏阴性菌的一线防御AMP——ALF得以正常表达，而无需额外上调PEN4；相反，低剂量Ccombody可能不足以完全中和PirA毒素，导致肝胰腺损伤，促使代偿性上调次级AMP如对虾素以维持免疫活性。PCA结果与基因表达结果一致，证实Ccombody并非组成性激活免疫系统，而是在病原暴露时发挥启动或增强免疫应答的作用。Ccombody补充组死亡率较阳性对照组极显著降低，且10和100 mg/100 g饲料组死亡率显著低于Ig-Guard A组，呈现剂量相关趋势。与基于细胞系文库来源的VLRB相比，本研究采用经抗原刺激盲鳗后分离淋巴细胞并直接纯化获得的PirA特异性VLRB，可能解释了其增强的功效。研究结论指出，饲料添加Ccombody可显著提高感染后对虾存活率，proPO-2、ALF-1和PEN4等关键免疫基因的表达谱表明Ccombody间接调节宿主先天免疫应答，可能在Vp_AHPND攻毒后支持免疫基因表达的维持。这些结果凸显了基于VLRB的重组抗体作为对虾养殖中AHPND防控预防策略的应用潜力。未来研究应涵盖更广泛的对虾发育阶段和更频繁的采样间隔，并评估更多免疫参数、免疫相关基因表达谱及肝胰腺和胃肠道的组织病理学变化，以阐明Ccombody的作用机制。