复杂肝脏基质中PFAS操作可靠定量：面向LC–MS/MS分析的商用净化柱系统优化

《Journal of Chromatography B》：Toward operationally reliable PFAS quantification in complex liver matrices: Systematic optimization of commercial Cleanup cartridges for LC–MS/MS analysis

• 针对肝脏基质中的全氟和多氟烷基物质（PFAS），对商用净化柱进行了优化。
• 该工作流程通过液相色谱–串联质谱（LC–MS/MS）定量了34种传统和替代PFAS。
• 使用0.10 g干组织实现了可靠的经内标（IS）校正的回收率。
• 实现了低方法检出限（MDLs）以及低于15%的批内/批间变异系数（CVs）。
• 该方法适用于肝脏、肾脏和肌肉组织。

论文主体解读：

全氟和多氟烷基物质（PFAS，至少含一个碳–氟键的合成有机化学物）具有防水、防油、热稳定和化学稳定等性质，广泛用于氟聚合物、防水泡沫与涂层、纺织和纸张表面处理以及镀铬等工业过程。由于使用广泛且环境持久，PFAS已在多种环境介质和生物体中检出，并表现出生物累积潜力。体内研究显示，PFAS可诱导肝脏、胰腺和甲状腺肿瘤发生率升高、脂质代谢紊乱、肝肿大和肝细胞损伤。全氟辛烷磺酸（PFOS）于2009年被列入《斯德哥尔摩公约》附件B，全氟辛酸（PFOA）和全氟己烷磺酸（PFHxS）分别于2019年和2022年被列入附件A，2025年长链全氟羧酸（PFCAs）被列入附件A。PFNA、PFDA、PFUnDA、PFDoDA、PFTrDA、PFTeDA、HFPO-DA和PFBS等也被列为REACH高度关注物质。尽管已有管控，历史使用使其难以完全消除，结构类似替代PFAS仍持续产生和使用；全氟烷基醚磺酸（PFESAs）和全氟烷基醚羧酸（PFECAs）等替代物已在环境、人体和野生动物中报道，其毒性和生物累积资料仍不足。野生生物器官和组织中已发现替代及新兴PFAS，许多离子型PFAS倾向蓄积于肝脏，也可在肾脏和胆汁中检出。肝脏优先蓄积与PFAS对肝脂肪酸结合蛋白、血清白蛋白以及过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）等靶蛋白的亲和性有关。然而，哺乳动物器官和组织，尤其野生动物肝脏中PFAS分析仍很困难：生物基质复杂，PFAS结构多样，可靠定量既需有效提取，也需去除共提取内源性组分。碱消化较离子对提取效率高，但会共提取蛋白质、脂质和胆汁酸，导致LC–MS/MS中离子抑制、共洗脱和干扰，并污染离子源和色谱系统，降低灵敏度、导致信号不稳和频繁维护。采用Oasis WAX等弱阴离子交换（WAX）固相萃取（SPE）可保留离子型PFAS，但去除复杂生物基质效果有限；弃去中性甲醇级分可部分去除中性脂质，但会损失全氟烷基磺酰胺（FASAs）等中性PFAS；牛磺脱氧胆酸（TDCA）也会共洗脱。石墨化碳黑（GCB）可去除TDCA和平面基质组分，但蛋白质和甘油三酯可能残留。WAX–GCB联合净化仍不能完全解决基质干扰。许多既往方法用肌肉组织验证，而肝脏蛋白质、胆汁酸、色素及脂质更高，基质效应更强，需专门针对肝脏系统评价提取和净化策略。人肝脏直接分析受伦理和实践限制，家猫与人共享生活环境，可作为评估PFAS暴露及健康影响的哨兵物种，但猫器官组织PFAS蓄积和分布仍表征不足。基于此，研究人员以家猫肝脏为主要基质，开发并验证适用于多种传统及替代/新兴PFAS的实用可靠分析方法，并考察其用于其他器官、组织和其他野生动物肝脏的可行性。

关键技术方法（≤250字）：研究人员比较了六种样品制备流程：以KOH辅助碱性甲醇消化结合Strata PFAS（WAX与GCB堆叠）为参考流程，逐步引入Captiva EMR Lipid 300 mg、乙腈蛋白沉淀、净化顺序反转、Captiva EMR Lipid 600 mg以及Captiva EMR Food II，并采用LC–MS/MS负电喷雾电离（ESI）多反应监测（MRM）和同位素稀释法分析。样品来源包括：2008年日本爱媛县交通事故死亡雄性猫肝脏用于流程优化；日本大阪府2008–2023年六只成年普通鸬鹚（Phalacrocorax carbo，雄性3只、雌性3只）肝脏，以及2010年大阪府六只雄性成年猫肝脏，均存档于爱媛大学es-BANK并于?25 °C保存；另分析猫肾脏和肌肉组织。每份冻干样品取0.10 g。验证指标包括基质效应、绝对回收率、内标（IS）回收率、IS校正回收率、批内和批间变异系数（CVs）、方法检出限（MDLs）、处理后样品稳定性，并用NIST^? SRM^? 1947鱼组织标准参考物质进行外部准确性评价。

3.1 Optimization procedures：研究人员通过六种流程比较提取化学、吸附剂选择性和容量、净化顺序对肝脏PFAS回收和基质去除的影响，结论是最终方法并非简单经验筛选，而是基于机制优化；稳定同位素稀释对肝脏提取物可靠定量必要。

3.1.1 Comparison of matrix effect between procedures (1)–(6)：通过净化后加标比较基质效应，Procedure (2)对6种目标物出现低于?50%的信号抑制；Procedure (4)顺序反转后抑制更强，平均低于?50%；Procedure (5)较大容量Captiva EMR Lipid改善部分分析物但仍有5种低于?50%；Procedure (6)无分析物低于?50%，净化最佳。FTSAs在Procedure (5)和(6)出现信号增强，研究人员认为与LC–MS/MS系统中吸附–解吸过程有关。

3.1.2 Comparison of absolute recovery between procedures (1)–(6)：通过加标肝样比较绝对回收率，参考WAX/GCB的Procedure (1)许多目标物回收率低，超过50%目标物≤30%，且仪器灵敏度明显下降；Procedure (2)较(1)有24种化合物回收提高，但所有化合物仍低于30%，长链PFAS损失明显，可能与疏水性及延长浓缩中塑料吸附有关；Procedure (3)更差，30种化合物低于30%，说明KOH蛋白水解优于乙腈蛋白沉淀；Procedure (4)因顺序反转导致基质抑制更明显，回收低于(2)；Procedure (5)使25种化合物绝对回收超过50%，但NFDHA低于30%；Procedure (6)使29种化合物超过50%，PFPeA、PFTeDA、FBSA、FOSA和HFPO-DA略低。IS绝对回收率在(1)–(4)多数低于50%，而(5)和(6)分别有13和16种IS超过50%；Procedure (6)中M₃HFPO-DA为49%、M₈FOSA-I为46%。FTSAs信号增强在目标物和IS回收中均出现。

3.1.3 Comparison of IS-corrected (relative) recovery between procedures (1)–(6)：通过同位素稀释校正回收率比较，Procedure (6)有36种化合物（区分线性和支链PFAS时）平均IS校正回收率在70–120%可接受范围，数量最多；Procedure (5)有32种。Procedure (6)的CVs低于10%，Procedure (5)低于14%。前4种流程因强基质抑制或分析物损失，IS校正效果和重现性不足。结论是Procedure (6)总体性能最佳，Procedure (5)保留用于验证，以比较吸附剂类型和容量影响。

3.2 Validation of the developed analytical method：研究人员对Procedure (5)和(6)进行验证，评价精密度、处理后样品稳定性、MDLs和标准参考物质准确性。

3.2.1 Precision and processed-sample stability：通过单批内三份加标样和三个批次间三份加标样评价精密度，Procedure (5)多数目标物精密度可接受，但部分化合物批内或批间CVs超过15%；Procedure (6)批内和批间CVs均低于15%。PFUnDA、PFTrDA和PFOS的CV较大，因猫肝中这些PFAS本底浓度与加标量相当或更高；IS变异仍在可接受范围。Procedure (6)处理提取物冷藏7天后，天然物绝对回收率、IS绝对回收率和IS校正回收率无显著差异，表明一周内稳定。

3.2.2 Method detection limits (MDLs) in procedures (5) and (6)：通过重复测量计算MDLs，Procedure (5)所有目标PFAS为0.0078–0.35 ng g^?1干重，Procedure (6)为0.0091–0.55 ng g^?1干重。针对PFCAs（C₅–C₁₄）和PFSAs（C₄、C₆、C₈），Procedure (5)为0.022–0.35 ng g^?1干重，Procedure (6)为0.013–0.35 ng g^?1干重，与既往海豚肝等研究趋势相当；本方法所需样品量较少，适合组织量有限的稀有野生动物研究。

3.2.3 Evaluation of method accuracy and interlaboratory comparability using standard reference material：通过分析NIST^? SRM^? 1947鱼组织评价准确性，测得PFOS（线性和支链异构体之和）为2.04 ± 0.05 ng g^?1湿重，NIST参考值为2.19 ± 0.08 ng g^?1湿重，相对差异在10%以内。PFNA、PFDA、PFUnDA、PFDoA、PFTrDA、PFTeDA、PFDS和FOSA也与Bundesamt fuer Seeschiffahrt und Hydrographie实验室间研究报道值一致。结论是方法真实性和实验室间可比性良好，但该标准参考物质非肝脏基质，因此作为更广泛适用性的支持性证据。

3.3 Application of the developed method for biological PFAS monitoring：研究人员将Procedure (6)用于猫肝、猫肾和肌肉以及普通鸬鹚肝，评估实际生物监测适用性。

3.3.1 Application to cat liver samples with known hepatic lipid content：通过已知肝脂质2.7–6.5%的猫肝样品评估，多数目标PFAS的IS回收率≥50%；长链PFCAs几乎全部≥50%；M₂PFTeDA是唯一IS回收低于50%的PFCA，但仍高于30%。M₈PFOA回收为61–82%，M₇PFUnDA为77–91%，M₈PFOS为52–72%；脂质高于5%的样品回收略低但仍高于50%。M₈FOSA-I回收较低，为25–40%，但在6.0%脂质样品中仍为38%。结论是Procedure (6)适用于所考察脂质范围的肝脏，更高脂质或更易受基质损失的分析物仍需改进前处理。

3.3.2 Applicability to cat tissues with different matrix compositions：通过猫肾和肌肉样品评价，多数目标PFAS的IS回收率在可接受范围，CVs通常低于15%。肌肉中回收率通常高于肝脏，尤其长链PFCAs和PFOS；C₄–C₁₂ PFCAs在肌肉中为71–110%，在肾脏中为43–57%；M₈PFOS在肌肉中为88%，在肾脏中为70%。d₅-N-EtFOSAA在肌肉中回收率异常高，为170%。肾脏对若干分析物回收略低，但多数仍高于40%且精密度可接受。实际检测中，肾脏PFAS检出频率和浓度高于肌肉，Σ₃₇PFASs中位浓度分别为8.1和0.46 ng g^?1湿重；长链PFCAs尤其PFUnDA和PFTrDA为主，PFOS为主要PFSA，肾脏中还检出FOSA、L-MeFOSAA和9Cl-PF3ONS。结论是该方法可用于具有不同基质组成和PFAS浓度范围的猫组织。

3.3.3 Cross-species applicability to common cormorant liver：通过普通鸬鹚肝加标回收实验评价跨物种应用，实验和数据由不同人员独立完成。基质效应最大抑制为?21%，低于猫肝；排除FTSAs后离子增强最高为+38%，与猫肝相当。除支链PFOS和FTSAs外，几乎所有PFAS平均绝对回收率在50–120%；支链PFOS为41%，略低。多数分析物IS校正回收率为70–120%。结论是Procedure (6)在不同动物物种肝脏和不同分析人员操作下可提供可重复、可靠的PFAS定量。

3.3.4 PFAS profiles in cat and common cormorant liver samples：通过分析六份普通鸬鹚肝和六份猫肝样品，除传统长链PFCAs和PFOS外，还检出多种替代PFAS，包括FASAs、9Cl-PF3ONS和11Cl-PF3OUdS。日本猫和鸬鹚肝中PFAS此前未见报道；本研究总PFCA（C₄–C₁₄）和PFSA（C₄、C₆、C₈、C₁₀）浓度在普通鸬鹚中为60–670 ng g^?1湿重，在猫中为2.8–15 ng g^?1湿重，一般落在既往报告范围内。普通鸬鹚肝中检出FOSA、EtFOSAA和9Cl-PF3ONS，与欧洲野生动物既往报道一致。

4. Conclusions：研究结论部分翻译如下。该研究开发并验证了一种样品制备工作流程，用于通过LC–MS/MS测定复杂肝脏基质中的传统和替代PFAS。尽管该方法比一些现有流程更费人力，但这一权衡因其对肝脏组织的改进性能而合理，因为较简单方法可能无法提供足够净化以保证可靠PFAS定量。该工作流程经过系统优化，以减少基质来源离子抑制、最小化分析物损失，并通过同位素稀释校正保持定量稳健性，同时仅用0.10 g干组织即可测定34种PFAS。最终提出的Procedure (6)将碱性甲醇消化与Captiva EMR Food II和Strata PFAS柱顺序净化相结合；其有效性由多数目标分析物可接受的IS校正回收率、低基质效应、低于15%的批内和批间CVs以及低MDLs所证明。尽管部分PFAS绝对回收率并非都高，但稳定同位素稀释有效补偿了可重现的基质相关损失，使结构多样的PFAS能够可靠定量。该方法以猫肝为主要基质验证，并进一步显示适用于普通鸬鹚肝，支持其用于不同动物物种肝脏组织PFAS分析。对猫肾脏和肌肉样品的额外应用表明，该工作流程也可用于具有不同基质组成和PFAS浓度范围的猫科组织。总体而言，所提出方法不依赖特殊吸附剂或定制材料，而是提供基于商用净化柱的操作可靠且可转移的分析框架。该方法尤其适用于表征复杂肝脏基质中的PFAS残留，肝脏是PFAS蓄积的关键部位，并应有助于未来野生动物监测、组织分布研究和环境暴露评估。