聚乙二醇（PEG）相关脂质纳米颗粒（LNP）效力丧失在mRNA递送的配方调整中持续存在

《Drug Delivery and Translational Research》：PEG-associated efficacy loss in lipid nanoparticles persists across formulation modifications for mRNA delivery

专业摘要翻译 脂质纳米颗粒（LNPs）是经过临床验证的mRNA递送载体，通常需要重复给药以维持治疗效果或预防效益。然而，单次给药即可激发针对聚乙二醇（PEG）（一种位于LNP表面的聚合物辅料）的适应性免疫应答。在此情况下，产生的抗PEG抗体中和后续的LNP剂量，导致效力丧失并限制治疗效用。本研究调查了改变初次与后续剂量之间的LNP配方是否能够减轻PEG相关的效力丧失。在给予已知会引发抗PEG抗体的LNP后，研究人员用具有不同PEG-脂质化学结构、PEG浓度、mRNA载荷和给药途径的LNPs进行再次给药。这些调整均未能阻止效力丧失，而效力丧失始终与升高的抗PEG免疫球蛋白M（IgM）以及在部分情况下的免疫球蛋白G（IgG）水平相关。降低PEG浓度减弱了免疫原性，但也降低了效力；腹腔内给药在重复注射时引发了最强的反应。此外，引发抗PEG抗体的LNPs也损害了随后给药的FDA批准的MC3配方的递送效率，表明抗PEG免疫应答可以损害任何PEG化的LNP配方。综上所述，这些发现表明，当可电离脂质无法激活先天免疫受体TLR4和CD1d时，仅通过优化配方无法解决PEG相关的效力丧失问题。相反，研究结果提示，可电离脂质对先天免疫受体的激活是决定重复给药成功与否的主要因素。

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研究背景与目的

脂质纳米颗粒（LNPs）是目前最先进的非病毒RNA递送载体，已在patisiran和COVID-19 mRNA疫苗等应用中取得临床成功。除了疫苗接种，LNPs在蛋白替代疗法、基因治疗和免疫治疗等领域也展现出巨大潜力。由于mRNA表达是瞬时的，许多治疗应用（如慢性蛋白替代疗法和基因调控治疗）都依赖于重复给药以维持疗效。然而，一些有效的LNP配方在重复给药时会出现效力丧失，这一问题被归因于针对LNP表面聚乙二醇（PEG）成分产生的抗PEG抗体，即加速血液清除（ABC）现象。

此前的研究表明，特定可电离脂质（如304O_i10）无法激活先天免疫受体TLR4和CD1d，导致机体无法抑制抗PEG IgM的产生，从而造成重复给药失败。本研究的核心问题是：在保持这种“缺陷型”可电离脂质不变的前提下，通过修改其他配方参数（如PEG-脂质化学结构、PEG浓度、mRNA载荷和给药途径）是否能够挽救重复给药的效力？此外，由一种LNP引发的抗PEG免疫是否会干扰另一种基于不同可电离脂质的LNP（如FDA批准的MC3配方）的后续递送？

研究方法与技术

研究人员采用了一系列体内实验方法。主要技术包括：合成特定可电离脂质（304O_i10和DLin-MC3-DMA）；利用闪速纳米沉淀法配制负载不同mRNA（萤火虫荧光素酶或人促红细胞生成素EPO）的LNPs；通过动态光散射（DLS）和RiboGreen RNA测定法表征LNPs的粒径、多分散性和RNA包封率；使用TNS分析法评估LNPs在不同pH下的电离特性。动物实验方面，在C57BL/6小鼠模型中，通过静脉（IV）、肌肉（IM）或腹腔（IP）注射给予LNPs，并在固定时间点采血。通过活体成像系统（IVIS）检测荧光素酶表达，通过ELISA检测血清中的EPO浓度以及各类抗体（总IgM、抗PEG IgM、总IgG、抗PEG IgG）水平。

研究结果

1. 效力丧失在不同mRNA载荷下持续存在并与抗PEG抗体产生相关

研究人员发现，无论负载的是萤火虫荧光素酶还是人促红细胞生成素（EPO）mRNA，含有304O_i10的LNPs在重复给药后均表现出显著的效力下降。特别是EPO组，第三次给药后的血清水平较首次下降了约80倍。抗体分析显示，效力丧失与抗PEG IgM和IgG水平的升高密切相关，且不同mRNA载荷引发的抗体反应强度和动力学存在差异，表明mRNA载荷本身会影响PEG驱动的适应性免疫的严重程度。

2. 给药途径影响效力丧失的幅度但不影响其发生

通过IV、IM和IP三种途径给药，所有途径均观察到显著的效力丧失。其中，IP给药导致的效力丧失最为严重（约9.7倍），同时伴随最高的抗PEG IgM诱导水平。这表明，虽然给药途径决定了LNP首先接触的免疫细胞群体，从而影响免疫反应的强度，但并不能从根本上避免PEG介导的效力丧失。IP途径因其直接暴露于富含巨噬细胞和B细胞的腹腔环境，可能放大了免疫监视效应。

3. PEG-脂质化学结构改变抗体反应幅度但不阻止效力丧失

比较了三种常用PEG-脂质：PE-PEG2000、PE-PEG750和DMG-PEG2000。尽管所有配方的效力丧失程度相似（约3.1至4.7倍），但抗体反应存在显著差异。DMG-PEG2000诱导了最强的抗PEG IgM反应（高达125倍增加）。这表明，PEG-脂质的化学结构（尤其是连接基团）可以调节适应性免疫反应的强度，但一旦抗PEG抗体超过某个阈值，效力丧失便不可避免。

4. 有效递送所需的PEG浓度同样诱导抗PEG抗体

研究人员测试了从0%到2.5%的PE-PEG2000摩尔比例。结果显示，只有当PEG浓度达到≥1.0%时，LNPs才能实现有效的EPO表达，但这些配方也无一例外地引发了显著的抗PEG IgM和总IgG升高，并在重复给药后出现效力丧失。相反，≤0.5% PEG的配方虽未引起免疫反应和效力丧失，但其递送效率极低，与PBS对照组无显著差异。这揭示了一个“效力-免疫原性权衡”现象：足够的PEG是LNP发挥效力的必要条件，但这一浓度也足以触发有害的适应性免疫。

5. 抗PEG免疫损害跨配方的LNP给药

研究人员设计了一系列交叉给药方案，交替使用304O_i10 LNPs和FDA批准的可电离脂质MC3 LNPs。结果表明，只要初次给药使用了304O_i10 LNPs，无论后续使用的是同种LNP还是MC3 LNP，都会出现显著的效力丧失。即使是在首次使用MC3后改用304O_i10，第三次再换回MC3，其效力也会受损。这说明，由“缺陷型”可电离脂质引发的抗PEG抗体能够识别并中和任何含有PEG的LNP，包括那些基于临床验证的可电离脂质的配方。

总结与结论

这些研究证实，PEG相关的效力丧失在PEG-脂质化学结构、PEG浓度、mRNA载荷和给药途径等多种配方变化下均持续存在。更重要的是，由304O_i10 LNP建立的抗PEG免疫会损害后续MC3 LNP的性能，证明这不是一个配方特异性的缺陷，而是PEG导向适应性免疫的根本性后果。

研究结论指出，当可电离脂质（如304O_i10）无法激活先天免疫受体TLR4和CD1d时，下游的任何PEG-脂质修饰都无法补偿。因此，实现持久重复给药的关键在于解决LNP与先天免疫系统之间的免疫学界面问题，这可以通过选择能够主动抑制抗PEG反应的可电离脂质、开发真正无PEG的递送平台，或靶向调控控制抗聚合物抗体产生的免疫通路来实现。