### 中文标题 食品级微生物组靶向干预对大学生耐力运动员生理及肠道生态系统影响的性别与时间分辨随机对照研究

《Advanced Science》：Sex- and Time-Resolved Physiological and Gut Ecosystem Responses to a Food-Grade Microbiome-Targeted Intervention in Collegiate Endurance Athletes

### 论文摘要专业翻译

耐力运动员在高负荷训练期间承受持续的生理需求，然而在真实世界环境中针对微生物组靶向干预的证据仍然有限。研究人员开展了一项两阶段、随机、双盲、安慰剂对照试验，将150名运动员按2:1比例分配至联合益生菌-酵母提取物（CPYE）组或安慰剂组，干预持续6周；其中44名确认参加第12届内蒙古自治区大学生运动会的完成者进入了为期6周、伴随强化训练的探索性延长期。通过整合可穿戴设备衍生的表型分析、现场心肺指标、临床评估、粪便宏基因组学及代谢组学，研究人员发现，在随机化短期阶段，与安慰剂相比，CPYE与设备估算的最大摄氧量、运动心率指标、乳酸及氧化还原生物标志物的变化相关。探索性性别分层分析提示存在异质性反应模式，而选择性长期延长期则显示随时间依赖的变化，有待进一步确认。多组学分析鉴定出微生物分类群、功能、代谢物及网络拓扑结构存在性别和阶段相关的差异。间接效应模型提名了候选特征（rmlD、PISD相关的磷脂酰乙醇胺通路、卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus）及叶酸相关功能）作为宿主结局的潜在间接相关因素。这些发现支持在大学生耐力运动员中进一步评估CPYE相关反应；亚组、长期、网络及间接效应结果为假说生成性的。

### 论文深度解读

#### 研究背景与问题

耐力运动员在长时间、高容量的训练周期中承受着持续而显著的生理压力。即便在成绩、恢复和抗压能力上的微小改善，在竞技层面也可能产生重要影响。尽管周期化训练、营养优化和先进恢复方案已大幅提升了运动准备的科学化水平，但在既有框架内进一步挖掘运动表现提升空间的潜力正日益受限。因此，寻找安全、合规且能无缝整合进现行训练体系、在持续训练压力下支持生理适应与恢复且不损害长期健康的干预手段，成为运动科学领域的前沿方向。

肠道微生物组作为连接饮食、运动应激与全身生理的关键界面，近年来受到广泛关注。越来越多的证据表明，肠道微生物的组成与功能可调节耐力表现、代谢灵活性、氧化还原稳态以及剧烈运动中的胃肠道耐受性。益生菌干预在减少运动相关胃肠道不适、降低上呼吸道感染发生率及改善部分成绩指标方面显示出温和但具前景的效果。动物模型机制研究进一步证明，特定微生物（如利用乳酸的韦荣球菌属）可将运动来源的乳酸转化为具有生物活性的短链脂肪酸，从而增强肌肉能量代谢与耐力。与此同时，富含核苷酸、游离氨基酸和小肽的酵母提取物可支持肠道屏障完整性，并为共生菌群提供底物，进而增强黏膜免疫和微生物稳定性。基于这些理论基础，研究人员在试验启动前即选定了一种由益生菌与酵母提取物组成的联合制剂（CPYE），并依据前期动物实验和已发表证据确定了具体菌株（即副干酪乳酪杆菌Zhang与动物双歧杆菌乳亚种ProSci-246）及配方剂量。

尽管概念上颇具前景，现有证据仍较为零散。多数人体试验依赖狭窄的结果指标，如单时间点成绩测试、有限生物标志物组合或低分辨率微生物组谱，极少将深层生理表型分析与高分辨率多组学数据加以整合。更重要的是，运动适应和微生物组动态均天然具有时间依赖性，但鲜有研究在同一队列中系统性比较短期与持续干预效果的差异。此外，性别是运动生理学中的基本生物学变量，男女在底物利用、激素调节、身体成分和训练反应性上存在显著差异，然而在微生物组研究中，性别常被作为统计混杂因素而非主要生物学变异轴来处理。最后，尽管多组学方法已开始描绘微生物特征与宿主性状之间的关联，但在人类中，受到统计学支持且具有生物学可解释性的微生物组靶向干预与身体功能改善之间的联系仍然有限。

#### 研究设计与方法

为填补上述空白，研究人员开展了一项两阶段、随机、双盲、安慰剂对照试验。研究于2023年3月至6月在中国内蒙古进行，纳入150名接受高负荷训练的大学生耐力运动员。参与者以2:1比例随机分配至CPYE组（n=100）或基质匹配的安慰剂组（n=50），CPYE日剂量含副干酪乳酪杆菌Zhang 4×10¹⁰ CFU、动物双歧杆菌乳亚种ProSci-246 2×10¹⁰ CFU及0.3 g酵母提取物（总剂量2 g/天），安慰剂含相同比例的低聚半乳糖和草莓粉。试验包含6周随机化短期（ST）阶段（第0-6周），随后44名确认参加第12届内蒙古自治区大学生运动会并接受强化训练的ST完成者进入6周长期（LT）延长期（第6-12周），原随机分组保持不变。在ST阶段第0、3、6周及LT阶段第6、8、10、12周进行访视，收集现场心肺指标、身体成分、睡眠/心率/压力可穿戴指标及系列生物样本。研究人员共评估45项互补指标，涵盖设备估算的最大摄氧量（VO₂ max，可穿戴衍生的现场心肺指数）、运动心率动力学、运动后血乳酸、空腹血糖、生物电阻抗衍生的身体成分估算、血清抗氧化与代谢标志物以及持续可穿戴衍生的睡眠、心率和压力指标。粪便样本同时进行鸟枪法宏基因组学和非靶向代谢组学分析，实现细菌、真菌、噬菌体群落、微生物功能通路及粪便代谢物网络的纵向表征。统计分析采用线性混合效应模型（LMM）、排列检验轨迹分析、置换多元方差分析（PERMANOVA）、成分张量分解（CTF）、MaAsLin2差异丰度分析、共现网络拓扑与模拟稳健性评估以及探索性间接效应模型。研究方案经内蒙古营养学会伦理委员会批准（批号A202207019），并在中国临床试验注册中心回溯注册（ChiCTR2500106261）。

#### 主要研究结果

**2.1 研究设计与基线队列特征**：150名随机参与者中，149人完成ST阶段（CPYE组99人，安慰剂组50人），44人进入LT阶段（CPYE组31人，安慰剂组13人）。基线特征显示随机分组间多数变量绝对标准化差异（SMD）较小，性别分布完全相同（女性56%，男性44%）；空腹血糖（SMD=0.41）和总抗氧化能力（T-AOC，SMD=0.83）的基线绝对SMD最大。LT入选者与未入选者在第6周时八个关键生理指标的绝对SMD均小于0.20，提示延长期开始时测量到的生理特征较为相似。

**2.2 CPYE相关的现场心肺、代谢和氧化还原指标变化**：在随机化ST阶段，CPYE与设备估算的VO₂ max升高及运动心率指标（ExHRave、ExHRmax）降低的纵向轨迹相关（p<0.05）；第6周时CPYE组运动后乳酸较安慰剂组降低1.351 mmol/L（95% CI，?2.530至?0.172；标称p=0.025），第3周时T-AOC和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性升高。第6周ExHRave在基线调整敏感性分析中仍低于安慰剂组（调整后差异?4.83次/分；95% CI，?8.64至?1.02；标称p=0.013），而乳酸和T-AOC对比在调整后有所减弱。多重插补意向性治疗分析（n=150）与观测数据分析高度一致。14项胃肠道问卷中，仅胸痛不适（Q04，标称p=0.029）和排便急迫感（Q13，标称p<0.001）两项出现组间名义差异，其余12项无明显差异。无参与者因产品不耐受退出，无不良事件被判定与干预相关。

**2.3 探索性性别与阶段分层生理反应模式**：无监督层次聚类显示基线生理聚类与生物学性别具有91.28%的一致性，因此进行了性别分层LMM分析。结果呈现四种探索性模式：（1）ST男性以代谢和氧化还原相关变化为主，乳酸和空腹血糖降低（p<0.05），T-AOC和GPX升高，丙二醛（MDA）降低；（2）ST女性表现为设备估算VO₂ max升高、ExHRave和ExHRmax降低（p<0.05），伴随身体质量、脂肪量、总体水减少，以及血清总蛋白、镁、磷升高；（3）LT男性显示去脂体重（FFM）、骨骼肌质量、骨量、蛋白质质量、细胞外水分（ECW）、细胞内水分（ICW）、T-AOC和GPX升高，空腹血糖和睡眠平均呼吸频率降低（p<0.05）；（4）LT女性表现混合关联：体脂百分比（PBF）降低、设备估算VO₂ max升高、ExHRave降低、T-AOC升高、低压力状态时间延长（p<0.05），但空腹血糖和MDA升高，静息心率（RHR）和平均RHR轻度升高。

**2.4 肠道多组学随干预阶段和性别的变异**：基于艾奇逊距离的全样本PERMANOVA显示，干预阶段（ST vs. LT，总和伪F=28.49）、处理（CPYE vs. 安慰剂，25.18）和性别（18.49）均与多个组学层的变异相关；LT阶段性别产生的伪F值大于处理（32.53 vs. 29.06；p<0.05）。成分张量分解（CTF）分析显示，女性在ST阶段即出现细菌、真菌、噬菌体和功能通路的CPYE-安慰剂分离（伪F值3.45–5.16，p<0.05），代谢物分离仅出现在LT阶段；男性ST阶段分离仅限于真菌、功能和代谢物，而细菌和代谢谱在LT阶段显示出最强的分离。α多样性（香农指数、辛普森指数、物种丰富度）在组间、时间点和性别分层间未显示一致差异。

**2.5 CPYE相关的微生物分类群、功能和代谢物变化**：MaAsLin2分析（探索性筛选阈值Benjamini–Hochberg校正q<0.25）保留了823个候选特征：59个细菌分类群、11个真菌分类群、1个噬菌体分类群、422个微生物功能通路和330个代谢物。ST阶段候选特征稀疏且以性别特异性为主；LT阶段保留特征增多，但跨性别重叠极小。仅在LT女性中检测到单一噬菌体分类群（Autographiviridae科）丰度降低。跨所有阶段和分层，仅有一个极小核心特征与CPYE一致相关，包括乳酪杆菌属（Lacticaseibacillus）、动物双歧杆菌乳亚种和副干酪乳酪杆菌（含所施用的Zhang菌株的物种）及有限代谢物，提示CPYE相关特征高度依赖干预时长和性别背景。

**2.6 肠道多组学网络拓扑与模拟稳健性差异**：基于823个候选特征构建Spearman相关共现网络。在全队列中，CPYE衍生网络在两个阶段均显示更高的边数、密度、连通性和模拟稳健性指标（ST阶段：18 813 vs. 12 779条边，平均路径长度2.58 vs. 3.80，最大连通分量比0.93 vs. 0.84；LT阶段：24 962 vs. 15 597条边，平均路径长度2.43 vs. 2.97，最大连通分量比0.97 vs. 0.90），度异质性更低（ST：0.86 vs. 1.28；LT：0.83 vs. 1.07）。最大数值对比出现在样本量较小的LT女性亚组（31 573 vs. 3868条边，密度0.09 vs. 0.01，平均路径长度2.23 vs. 5.24）。这些指标描述推断网络拓扑，不应解释为体内生态稳定性或功能恢复力的直接测量。

**2.7-2.11 探索性间接效应分析**：研究人员采用层次线性中介模型评估CPYE暴露、候选肠道特征与宿主结局之间的统计关联。在ST男性中，微生物一碳代谢（gcvT，K00605）、钴胺酰胺/B12合成（cobT，K00768）和铁硫簇组装（sufB，K09014）功能丰度降低与乳酸和空腹血糖的负向间接效应相关；S-腺苷甲硫氨酸合成酶（metK，K00789）等功能与GPX活性存在正向间接效应。在ST女性中，dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶（rmlD，K00067）对设备估算VO₂ max呈正向间接效应，而CDP-二酰甘油-甘油-3-磷酸3-磷脂酰转移酶（pgsA，K00995）等膜相关功能与身体成分指标相关。在LT男性中，PISD（磷脂酰丝氨酸脱羧酶，K01613）相关功能对设备估算VO₂ max呈正向间接效应，涉及氨基酸、核苷酸和能量代谢的功能与FFM、骨骼肌质量和蛋白质质量指标相关。在LT女性中，卵形拟杆菌（B. ovatus）和叶酸激酶（folK，K00950）对设备估算VO₂ max呈正向间接效应，胆汁酸：Na⁺共转运体（BASS家族，K03453）和L-乳酸脱氢酶复合蛋白（lldF，K18929）与身体成分指标相关，重金属外排泵CzcA（K15726）对MDA呈负向间接效应。所有间接效应结果均为探索性假说生成，不建立因果中介或定向生物学通路。

#### 讨论总结与研究结论

讨论部分强调，随机化ST阶段提供了主要干预比较，而LT延长期、性别分层分析、聚类分层分析、推断网络和间接效应模型均为探索性和假说生成性的。多重插补意向性治疗估计与观测随访数据的结果高度一致，支持ST效应估计对单一缺失记录的稳健性。基线调整敏感性分析细化了ST生理学发现的解读：第6周ExHRave降低和第3周T-AOC升高得到保留，而第6周乳酸和T-AOC对比减弱，提示结果应进行结果特异性和访视特异性解读，而非统一生理学画像。

性别分层分析揭示了ST男性以代谢和氧化还原变化为主、ST女性以现场心肺指标和身体成分变化为主的异质性模式；LT男性显示瘦组织估算相关性，LT女性则显示脂肪量、心肺和心脏代谢指标的混合关联。这些对比模式与公认的运动适应性别差异一致，但不建立性别特异性功效。基线生理聚类与生物学性别高度重叠（91.28%一致性），其独立贡献无法在本队列中区分。

肠道多组学发现与生理学异质性相对应：不同性别-阶段分层中鉴定了不同的微生物功能和代谢物候选特征，包括一碳代谢、钴胺酰胺合成、铁硫组装、细胞壁生物合成、磷脂代谢、氨基酸/核苷酸代谢、胆汁酸-乳酸-叶酸-组胺相关功能等。网络拓扑分析显示CPYE衍生网络具有更高连通性和模拟稳健性，但这一发现不能建立体内生态稳定性或功能恢复力。

研究优势包括真实世界训练背景、纵向设计、广泛表型化和生理-多组学数据整合。局限性包括：设备估算VO₂ max非代谢车直接测量；LT入选为随机化后选择，队列较小（n=44）且性别亚组有限；训练负荷、膳食摄入、激素状态和环境条件未系统量化；安慰剂为基质匹配（含低聚半乳糖）而非惰性，观察到的对比反映活性成分在共享基质内的增量效应，无法分离益生元特异性效应；筛选特征网络和间接效应模型描述统计关联而非因果关系。

**研究结论**：随机化6周ST阶段显示，CPYE与选定的现场心肺指标及代谢和氧化还原相关生物标志物的组间差异相关，并伴随处理相关的肠道多组学谱变异。探索性延长期进一步提示，反应模式可能随干预时长、性别和基线生理特征而变化，而网络和间接效应分析鉴定了可供实验随访的微生物和代谢候选特征。因此，本研究为测试基于生理学信息的微生物组靶向营养提供了框架，而非生态系统重塑或因果机制的确定性证据。最终，需要纳入直接气体交换测试、标准化成绩指标和靶向实验扰动的大型前瞻性试验，以确定这些发现的重复性、量级和生物学意义。