椎间盘退变与异常神经支配的双重靶向：RU@PEI-ZIF纳米平台通过dsDNA–cGAS轴的治疗策略

《Advanced Science》：A Dual-Functional Nanoplatform Targeting the dsDNA–cGAS Axis to Mitigate Disc Degeneration and Aberrant Innervation

　　

病理性感觉神经长入退变椎间盘（intervertebral disc, IVD）参与椎间盘源性疼痛（discogenic pain），但同时缓解椎间盘退变（disc degeneration, IVDD）与异常神经支配的策略仍有限。研究人员发现，衰老的髓核（nucleus pulposus, NP）细胞积累并释放双链DNA（double-stranded DNA, dsDNA），可加重NP细胞衰老与基质分解代谢；积累的dsDNA还可激活环鸟苷酸–腺苷酸合成酶（cyclic GMP–AMP synthase, cGAS）–干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes, STING）信号，上调Netrin-1表达，促进神经元迁移与神经突生长。基于此，研究人员构建RU@PEI-ZIF双功能纳米平台，以聚乙烯亚胺（polyethyleneimine, PEI）介导dsDNA清除，以沸石咪唑酯骨架-8（zeolitic imidazolate framework-8, ZIF-8）递送cGAS抑制剂RU.521。该平台具有dsDNA结合能力、细胞相容性及pH响应释放RU.521特性。在衰老NP细胞中，其降低胞外与胞质dsDNA，减弱cGAS–STING相关炎症与神经营养信号，并抑制NP细胞介导的神经元迁移和神经突生长。在IVDD动物模型中，椎间盘内给药可减少椎间盘退变、NP细胞衰老、病理性感觉神经支配及痛觉过敏。上述结果支持RU@PEI-ZIF作为同时靶向椎间盘退变与病理性神经支配的双作用纳米治疗策略。

研究背景方面，椎间盘退变是腰痛（low back pain, LBP）的关键病理基础，会造成残疾与社会经济负担。退变破坏微环境稳态，使无神经的髓核出现异位感觉神经纤维长入，结合神经元敏化形成椎间盘源性疼痛的解剖基础。现有非甾体抗炎药、物理治疗、手术及再生策略多为姑息治疗，不能抑制病理性神经长入。衰老细胞释放的介质可驱动退变肌骨疾病中的异常感觉神经支配；退变椎间盘中，衰老NP细胞具有细胞周期停滞与衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP），持久DNA损伤可导致胞质dsDNA积累与胞外dsDNA释放，并被cGAS感知后激活STING信号。但衰老NP细胞释放的dsDNA能否促进其他NP细胞衰老、cGAS–STING是否连接DNA应激与轴突导向分子表达仍不清楚。该论文发表在《Advanced Science》，研究人员据此开展机制研究与纳米平台构建。

主要关键技术方法包括：重新分析5个公开单细胞RNA测序数据集以解析NP细胞亚群与细胞间通信；采用人对照与退变椎间盘标本进行组织学与免疫荧光分析；利用大鼠尾椎间盘针穿刺模型评价退变、痛觉与神经支配；通过复制性衰老与H₂O₂氧化应激建立NP细胞模型；使用RNA测序分析转录组与通路；以ZIF-8为载体的PEI修饰与RU.521装载构建纳米平台，并开展理化表征、药物释放与dsDNA结合实验；体内通过椎间盘内注射进行疗效与生物分布评估，并以AAV介导Netrin-1敲低验证体内功能。

研究结果如下。2.1 衰老NP细胞与异常感觉神经支配和痛觉过敏相关：通过单细胞聚类、组织学、蛋白检测与行为学，研究人员发现Sen-NPC亚群在退变样本中增多，NP细胞衰老、炎症、基质分解、PGP9.5⁺与CGRP⁺纤维增加及机械/热痛觉过敏相关联。2.2 衰老NP细胞积累并释放dsDNA，可加重衰老与促神经支配活性：RNA测序、免疫荧光、ELISA、SA-β-Gal、Transwell与PC12共培养显示，胞内/胞外dsDNA升高可诱导P16、P21、MMP13与炎症因子表达，并促进神经元迁移和神经突生长；DNase I可部分逆转。2.3 dsDNA通过cGAS–STING信号促进Netrin-1相关促神经支配活性：RNA测序、GSEA、cGAS敲低、RU.521处理与Netrin-1敲低表明，dsDNA激活cGAS–STING并上调Netrin-1，进而增强PC12迁移与神经突生长；cGAS或Netrin-1抑制可削弱该表型。2.4 RU@PEI-ZIF纳米平台的合成与理化表征：SEM、TEM、DLS、Zeta、XRD、XPS、FT-IR、BET与TGA证明PEI修饰提高正电性与dsDNA结合能力，保留ZIF-8晶态与多孔结构，RU@PEI-ZIF载药量16.03%、包封率66.21%，并在pH 6.0较pH 7.4释放更多RU.521。2.5 RU@PEI-ZIF降低dsDNA负荷并减轻NP细胞衰老：细胞摄取、CCK-8、DNA结合、ELISA与免疫荧光显示，该平台减少胞外/胞质dsDNA、γH₂A、P16、P21、MMP13，增加aggrecan，SA-β-Gal阳性细胞减少。2.6 RU@PEI-ZIF抑制cGAS–STING以降低Netrin-1介导的感觉神经突生长：免疫荧光、Western blot、ELISA与PC12实验表明，其最强抑制cGAS、STING、Netrin-1、IL-1β、TNF-α、IL-6及神经元迁移/神经突生长；RNA测序显示SASP、神经元迁移、细胞衰老与神经营养通路下调。2.7 RU@PEI-ZIF减轻椎间盘退变、NP衰老与痛觉过敏：大鼠体内X线、T2 MRI、H&E、SO&FG、免疫组化与von Frey、Hargreaves实验显示，其最好保留椎间盘高度、T2信号、髓核结构与蛋白聚糖，降低P16、P21、CGRP⁺与PGP9.5⁺纤维，并提高机械阈值与热撤回潜伏期。2.8 RU@PEI-ZIF减弱退变椎间盘中dsDNA–cGAS–STING轴：体内免疫荧光与免疫组化表明，其降低γH₂A、dsDNA、cGAS、STING、Netrin-1、IL-1β、TNF-α，恢复aggrecan、II型胶原并降低MMP13。

讨论部分总结：研究人员指出dsDNA积累不是单纯损伤产物，而是NP细胞衰老与促神经支配微环境的放大因子；cGAS识别胞质dsDNA后激活STING依赖炎症，连接无菌炎症与衰老。Netrin-1作为分泌型轴突导向分子，可由NP细胞来源cGAS–STING诱导并促进异常感觉神经长入。PEI界面化在细胞相容浓度下兼顾dsDNA清除与RU.521局部递送，ZIF-8酸不稳定特性有利于退变椎间盘酸性微环境释放。RU@PEI-ZIF通过清除dsDNA与抑制cGAS产生协同效应，优于单模干预；但长期降解、体内清除与安全性和大动物/临床研究仍需推进。人类退变椎间盘中cGAS与Netrin-1升高支持转化相关性。

结论部分翻译：本研究中，研究人员发现dsDNA积累参与NP细胞衰老；数据进一步支持dsDNA应答性cGAS–STING信号与Netrin-1诱导在衰老NP细胞促神经支配表型中的功能作用。基于上述发现，研究人员开发RU@PEI-ZIF，将dsDNA清除与cGAS抑制整合于同一纳米平台。体外实验中，RU@PEI-ZIF减轻NP细胞衰老及炎症、基质分解与促神经支配反应；在大鼠IVDD模型中，其减少椎间盘退变、病理性神经支配与痛觉过敏。总之，这些发现为同时靶向病理性dsDNA积累与cGAS介导的DNA感知，从而缓解椎间盘退变与病理性神经支配提供了依据。