基于相差显微成像与YOLOv8x深度学习的Salmonella Typhimurium微菌落快速检测与鉴定

《Journal of Food Protection》：Rapid Detection of Salmonella Typhimurium Microcolonies Using Phase-Contrast Imaging and Deep Learning

　　

食源性病原体（foodborne pathogens）的早期检测对于提高食品安全和预防污染相关暴发至关重要。传统 Salmonella spp. 检测方法可靠，但需要延长孵育时间和劳动密集型操作，限制其用于快速筛查。在本研究中，研究人员开发了一种快速、自动化的检测框架，将相差显微术（phase-contrast microscopy）与基于YOLOv8x的深度学习（deep learning）模型整合，用于在微菌落（microcolony）阶段识别 Salmonella enterica serovar Typhimurium。研究人员收集了5,000张显微图像数据集，包括在清洁条件和食品基质（food matrix，洋葱）条件下的纯培养物和与 Escherichia coli K-12 的混合培养物，覆盖多个时间点（30 min至4 h）。该模型达到精确率（precision）0.891、召回率（recall）0.867和mAP@0.50为0.898。早在孵育2 h即可实现可靠检测，相比传统培养方法显著缩短所需时间。该模型在混合培养物中也表现出稳健性能，能有效区分形态相似的细菌种类。此外，实例级分析（instance-level analysis）实现了对微菌落生长动态（microcolony growth dynamics）随时间的定量表征。该方法为早期病原体检测提供了快速、准确且成本有效的策略，并在实时食品安全监测（real-time food safety monitoring）和微生物诊断（microbial diagnostics）方面具有强大潜力。

Namariq Dhahir、Malek Rababa、Bibek Koirala、Amer AbuGhazaleh和Anas AlSobeh等研究人员围绕食源性病原体早期检测开展研究。食源性疾病（foodborne diseases）构成全球健康挑战，并造成显著经济和社会负担。Salmonella spp. 为革兰阴性菌，包含超过2,500种血清型，其中非伤寒沙门氏菌（nontyphoidal Salmonella，NTS）是全球细菌性食源性疾病的主要原因之一。NTS感染可导致自限性胃肠炎、侵袭性菌血症和严重局灶并发症，尤其影响脆弱人群；多重耐药株的持续出现进一步增加治疗和控制难度。美国CDC估计，NTS每年引起约1.2×10⁶例疾病和约450例死亡。禽肉和猪肉产品污染还可造成显著经济损失。新鲜农产品也可在生产链多个环节被污染，2020年、2021年和2023年与洋葱相关的多州暴发突出表明农产品供应链仍易受 Salmonella 污染。当前检测方法包括培养法和非培养法。培养法可靠但通常需要富集和延长孵育，常延迟数天；免疫、分子和生物传感器方法更快，但分子方法需要昂贵设备和受训人员，免疫方法较简单但可靠性较低，生物传感器受成本和技术要求限制。更重要的是，多数常规方法仅在细菌显著增殖后检测，减少早期干预机会。人工智能（artificial intelligence，AI）和计算机视觉进展为自动化微生物分析提供可能，但针对微菌落阶段的检测仍有限。因此，研究人员假设将相差显微术（phase-contrast microscopy）与基于YOLOv8x的深度学习模型整合，可在早期孵育阶段快速、准确检测 S. Typhimurium（Salmonella enterica serovar Typhimurium）微菌落，即使在复杂样本背景中亦然。为此，研究人员建立了快速、自动检测框架，使用卷积神经网络（convolutional neural network，CNN）模型YOLOv8x，在培养后短时间内识别 Salmonella 微菌落。该集成方法相较传统方法具有快速、准确和成本有效的特点，并有望通过更早发现污染事件和及时采取预防措施，改善食品安全监测。

关键技术方法：研究人员采用相差显微术（phase-contrast microscopy）与YOLOv8x目标检测。数据集5,000张图像，含纯培养、混合培养和背景，分无洋葱/有洋葱，采集于30 min至4 h的八个时间点。S. Typhimurium来自North Carolina A&T State University食品微生物实验室，E. coli K-12购自Sigma-Aldrich；洋葱样本n=20购自美国Illinois Carbondale当地杂货店，每周两个；低污染实验各10个样本，检测100 CFU/g和10 CFU/g。图像用IX73倒置显微镜采集，CVAT标注边界框和多边形分割掩膜，按70%/10%/20%划分训练、验证和测试。YOLOv8x用默认参数训练，输入640×640像素，以精确率、召回率和mAP@0.50评价，统计用方差分析（analysis of variance，ANOVA）和Tukey氏诚实显著性差异（Tukey’s honestly significant difference，HSD）检验。

微菌落发展与时间分辨成像：研究人员用IX73相差显微镜监测 S. Typhimurium 微菌落生长动态。单个细菌细胞在早期孵育期1–2 h伸长并分裂，形成小聚集；2–3 h可见明显微菌落，3.5–4 h扩展为更大、更密集结构。微菌落大小随孵育时间显著增加（p<0.05，单因素ANOVA）；Tukey’s HSD检验确认早期（≤2 h）与后期（≥3 h）以及连续时间点之间存在显著差异。约3.5 h后观察到从单层向多层组织转变，表明后期生长阶段结构复杂性增加。定量分析显示，前3 h平均微菌落面积逐渐增加，随后加速扩展；2 h平均菌落面积达48 μm²，至4 h增加超过40倍。2 h时微菌落已具备足够生物量和形态特征，可用于可靠下游识别，因此该时间点被选为早期检测点。

YOLOv8x检测性能：早期图像（≤1.5 h）因形态分化有限而具挑战，后续分析集中于微菌落更明显的较晚时间点。数据集注释质量较高，注释者间一致性为97.3%。YOLOv8x将检测和识别整合到单次推理步骤中，可分别实时识别 S. Typhimurium 和 E. coli K-12 微菌落。定量评价显示模型性能稳健，精确率为0.891，召回率为0.867，交并比（intersection-over-union，IoU）阈值为0.50时的平均精度均值（mAP@0.50）为0.898。定性评估进一步确认微菌落定位准确，多数情况下类别分配正确。模型在混合培养和多个成像时间点保持稳定性能，表明在测试条件下具有较强泛化能力。

使用YOLOv8x鉴定细菌微菌落：为评估模型区分细菌种类的能力，研究人员在相同条件下对 E. coli K-12 微菌落成像，并使用按8:2体积比混合的 S. Typhimurium 与 E. coli K-12 混合培养物评估鉴定性能。混淆矩阵显示，YOLOv8x具有较强区分能力，S. Typhimurium 正确识别率为0.89，E. coli K-12 为0.88，类间误识别较少。具体而言，0.06的 E. coli K-12 实例被错误识别为 S. Typhimurium，0.04的 S. Typhimurium 实例被误识别为 E. coli K-12。漏检方面，0.05的 S. Typhimurium 和0.08的 E. coli K-12 实例未被检测到。背景列仅描述未匹配检测在两个细菌类别间的分布，并不代表假阳性率。总体而言，YOLOv8x可在混合培养物中可靠区分形态相似的细菌微菌落。

低水平污染条件下的检测：研究人员进一步用洋葱样品中连续稀释的 S. Typhimurium 接种物评估低水平污染条件。评估了100 CFU/g和10 CFU/g两个低污染水平，每个浓度使用10个样本。在100 CFU/g时，相差显微术和YOLOv8x检测框架在10个样本中的7个（70%）成功识别 S. Typhimurium 微菌落。当污染水平降至10 CFU/g时，在实验条件下10个样本均未检出微菌落。结果表明，该方法可在100 CFU/g成功检测，但在10 CFU/g较低污染水平下检测能力降低。

使用实例分割对微菌落大小进行定量分析：研究人员利用注释显微图像生成的实例级分割掩膜定量分析 S. Typhimurium 微菌落大小。2 h平均微菌落大小为48 μm²，2.5 h增至105 μm²，3 h为125 μm²；4 h出现明显扩展，平均大小达930 μm²，表明转入快速生长。代表性相差图像及相应实例分割掩膜进一步显示细胞数量和菌落面积随时间逐渐增加。

讨论部分总结：研究人员认为，基于YOLOv8x的成像框架与相差显微术整合，可在2 h孵育期内可靠检测和识别 S. Typhimurium 微菌落。2–3 h出现明显微菌落，随后快速扩展，4 h菌落大小显著增加；2 h平均大小48 μm²，提供足够形态特征用于准确识别。传统 Salmonella 检测虽灵敏且广泛采用，但耗时长、依赖人力，通常需数天形成可见菌落和确认检测。免疫和分子方法可在数小时内快速检测并保持高灵敏度和特异性，但免疫方法受抗体不稳定性和交叉反应限制，PCR、LAMP和RPA等分子技术常需专用仪器，可能受样品抑制物影响，且无法区分活菌与非活菌。相比之下，该研究提供快速、自动化、成本有效替代方案，具有高通量筛选和现场应用潜力。微菌落生长动态支持早期检测；时间分辨成像揭示由单细胞到结构化微菌落，再到约3.5 h后单层向多层转变。YOLOv8x在检测和识别任务中均表现较强，混淆矩阵确认 S. Typhimurium 和 E. coli 真阳性率高，类间误识别少；部分检测未匹配注释实例，与洋葱来源基质碎片等视觉相似非菌落特征存在一致。与基于菌落指纹和传统机器学习的方法相比，该方法在数据集规模和检测速度方面具优势；既往深度学习研究常受数据集小和变异性有限制约。实例分割进一步实现微菌落生长定量表征，将方法用途从检测扩展到不同条件下细菌行为的功能评估。应用上，2 h内检测 S. Typhimurium 对食品安全监测意义重大，可支持更早干预、降低暴发风险，并利于整合到常规筛查流程。局限性包括：研究在受控实验室接种条件下进行，虽可检测100 CFU/g，但污染水平更低时检测更困难，可能受细菌细胞在食品基质中异质分布及发育微菌落出现在显微视野中的概率影响；仅评估有限细菌种类和一种食品基质；模型选择基于架构理由和该成像模态的既往应用，而非经验性头对头比较；对基质来源碎片的稳健性仍需通过扩展视觉困难非菌落特征注释和训练中硬负样本挖掘加强。未来应评估自然污染样品、更低接种浓度、多样食品基质和更多细菌种类，并开展与替代检测器包括较新YOLO变体和Faster R-CNN等两阶段架构的控制基准比较。

研究结论翻译：本研究证明，将基于YOLOv8x的目标检测与时间分辨相差成像相结合，为 S. Typhimurium 的早期检测和鉴定提供了有效且快速的框架。该方法在保持高准确率的同时显著缩短检测时间，是图像微生物诊断和食品安全应用中有前景的进展。未来工作将侧重于将模型扩展到多样食品基质和微生物群落，以进一步增强其实用性。