人体微生物组扰动安全性评估中临床研究成分数据挑战的应对策略：迈向差异丰度与活性的定量评估

《Journal of Food Protection》：Methods to Address Compositional Data Challenges in Clinical Studies for the Safety Assessment of Human Microbiome Perturbations

　　

测序技术的进步使得在临床研究中能够对人体微生物组进行日益详细的表征，但针对与健康和疾病表征或安全性评估相关的微生物组调控的解读，在方法学上仍具挑战。由扩增子测序或鸟枪法测序产生的分类学图谱本质上是成分性的、稀疏的且受检测限制，这使差异丰度分析复杂化，并可能导致不稳定或误导性的结论，尤其是在低生物量环境中，污染和检测不足是令人担忧的问题。本文研究人员综述了用于分析和补充测序衍生的分类计数数据的策略，旨在获得关于微生物差异丰度和活性的更多定量信息。这些策略包括用于基于相对丰度分析的变换，以及基于数学假设或额外实验测量（如加标、广谱定量PCR和流式细胞术）的样本间偏差校正。研究人员发现，目前对于哪种方法最能解决成分性问题尚无共识，并且低水平微生物在健康和疾病中的检测水平及意义常被忽视。研究人员讨论了基于序列的方法的局限性，例如实验和分析过程引入的偏差，以及用于有意义差异丰度评估的活性测量。研究人员以细菌性阴道病为例，说明了需要整合流行率与丰度，以及协变量在模型中的重要性。总体而言，对微生物组扰动的有意义评估不仅需要差异丰度分析的统计正确性，还需要谨慎的研究设计、适当的测量选择、定量背景，以及对测序衍生数据的生物学和分析局限性的明确认识。

# 论文解读

人体微生物组与健康和疾病的关联促使临床研究关注饮食、益生菌、粪菌移植及化妆品局部应用等干预对微生物组组成的调节。然而，这类干预的作用模式尚未被充分理解，宿主相关终点也不明确。基于预防原则，需要对微生物组扰动进行安全性评估，常用方法是通过比较不同时间点或干预组的分类学差异丰度分析（differential abundance analysis, DA）来检测变化。测序技术的进步使得微生物组表征日益精细，但测序数据本质上是成分性的（各分类群相对丰度总和为1或100%），且存在稀疏性和检测限制。在低生物量样本中，污染和检测不足可能导致假信号。常规DA方法若忽视这些特征，可能产生不稳定的结论，因此有必要综述现有策略，以获得关于微生物差异丰度和活性的更定量信息。

研究人员综述了用于分析和补充扩增子或鸟枪测序所得分类计数数据的策略，包括相对丰度分析的统计变换、基于数学假设的样本间偏差校正，以及实验性定量方法如加标、广谱定量PCR（qPCR）和流式细胞术。综述发现，目前尚无解决成分性问题的最佳方法共识，低丰度微生物的检测水平及其在健康和疾病中的意义常被忽视。并以细菌性阴道病（bacterial vaginosis, BV）为例，说明需要同时考虑微生物流行率和丰度，并纳入协变量。该综述强调，有意义的微生物组扰动评估不仅需要DA分析的统计正确性，还需要周密的研究设计、适当的测量选择、定量背景以及对测序数据生物学和分析局限性的明确认识。

为开展这项综述，研究人员利用基于大语言模型的程序Elicit进行初步文献检索（访问时间为2025年12月17日至2026年5月1日），随后人工筛选和补充相关文献，重点覆盖DA分析假设、检测水平和实验验证。在案例数据分析中，研究人员使用R（v4.5.2）和ggplot2（v4.0.1）对来自Ravel等人公开的阴道微生物组数据重新绘图，运用Wilcoxon检验和Kruskal–Wallis检验进行组间比较，并通过计数物种数计算丰富度，用Pielou指数量化均匀度。

研究结果首先概述了处理成分性的两大类视角：统计方法与实验方法。不同测量读数均用于对测序相对丰度加权以校正样本间偏差。现有研究多聚焦于统计方法的性能评估，而较少关注检测限、微生物活力和宿主暴露效应。随后分别讨论各类方法。

**相对丰度分析的统计方法**：该部分比较了edgeR、DESeq2、metagenomeSeq、LDM、ALDEx2、LinDA、ANCOM、ZicoSeq和Corncob等工具。这些工具以不同方式处理成分性和零值，例如中心对数比（CLR）变换、零膨胀模型、伪计数等。但比较显示，方法间结果可能不一致，且大多源自转录组学，未必适应微生物组的稀疏性和成分性。低丰度特征和零值的处理方式会影响差异丰度结果。

**基于相对丰度测量数学推断绝对丰度DA**：ANCOM-BC通过采样分数概念“重新校准”相对丰度，Wrench引入经验贝叶斯策略进行零值替换和偏差校正，ALDEx3允许用户定义样本间偏差。但这些方法通常仅在统计框架内测试，很少与定量数据对比。不过，使用“参考框架”（reference frames），即对相对丰度间的对数比进行排序，可抵消样本间偏差，足以恢复与特应性皮炎相关的物种。机器学习方法也能推断绝对丰度，但需要训练数据且高度针对特定样本类型。

**实验加标加权相对丰度**：加标是在提取前加入已知量微生物细胞或在测序流程中加入合成核酸标准。例如Stammler等人提出向粪便样本中加入嗜盐菌和植物根际菌。该方法可估计细胞浓度并校准样本间相对丰度，但外源DNA可能来自非活力细胞，扩增效率和基因组拷贝数因物种而异。加标已用于证明短肠综合征患者与健康对照的细菌负荷无差异，以及模拟早产儿肠道定植动力学。

**PCR总负荷加权相对丰度**：通过广谱16S rRNA基因qPCR可平行估计总细菌载量（基因拷贝数），用于加权相对丰度以进行样本比较。该方法受限于拷贝数变异和标准曲线质量，但已用于跨人群比较；在特应性皮炎中，总负荷本身是疾病的重要特征。检测水平受循环数限制，微滴式数字PCR（dPCR）可能更适合检测低水平细菌。

**流式细胞术加权相对丰度**：流式细胞术基于颗粒前向和侧向散射区分细胞大小和表面性状，可计数完整细菌细胞，避免提取和引物偏倚，但需要高生物量样本。在克罗恩病中，考虑绝对微生物负荷后，相对丰度分析所鉴定的拟杆菌属和普雷沃氏菌属“生物标志物”被证明是假象，总负荷才是疾病生物标志物。

讨论部分指出，基于测序的测量常假设不同分类群具有可比检测性，但提取效率、扩增和注释在不同生物体和流程间差异很大。低生物量样本中污染可能掩盖目标微生物。以BV为例，阴道微生物组可划分为若干群落状态类型（community state types, CSTs），不同Nugent评分类别的样本在丰富度和均匀度上显著不同（Kruskal–Wallis检验P<2.2×10^?16）。若以乳酸菌缺失为特征，流行率可指示疾病，但绝对丰度也很重要，且乳酸菌水平在个体间差异大。生殖阶段、月经状态、种族、卫生习惯、性行为等混杂因素进一步影响微生物组组成，因此需要整合流行率、丰度和协变量的方法，如微生物组多变量关联线性模型（Microbiome Multivariable Associations with Linear Models, MaAsLin）。AI方法在风险评估中具有潜力，但依赖于信息丰富的宿主元数据。此外，核酸结合染料叠氮溴化丙锭（propidium monoazide, PMA）可区分活细胞，但需进一步评估。

研究结论翻译如下：相当多的注意力集中在成分数据分析（Compositional Data Analysis, CoDA）及相关统计方法上，以解决成分性并改善假阳性控制、一致性和敏感性，但对检测限、活力以及所测信号对健康与疾病解释的生物学相关性关注相对较少。目前尚不清楚哪种DA方法最合适。根据健康状况，流行率和总负荷是需要考虑的重要因素，混杂因素亦然；因此需要进一步开发诸如MaAsLin等方法来整合这些参数。对于微生物组扰动安全性评估研究而言，在微生物定向干预的作用模式被更好表征之前，宜在可行时测量微生物负荷、活力、宿主反应和元数据背景等互补信息，并透明记录实验和分析方法。更高的方法学透明度和更定量的测量也将为基于人工智能的方法改善微生物组扰动风险评估和机制解释提供更坚实基础。